 |
В заключении указывают, обнаружены или отсутствуют сальмонеллы в 25 г исследуемого продукта.
|
|
|
|
Индикация сульфитредуцирующих клостридий (СРК) основана на высеве навески (или его разведений) либо культуральной жидкости в железосульфитсодержащие среды и подтверждении принадлежности выросших при 370С в течение 72 ч микроорганизмов к СРК по морфологическим и культурально-биохимическим признакам. Наличие СРК в соответствии с Санитарными правилами и нормами не допускаются в 0,1 г консервированного продукта.
Исследование проводят для анализа микрофлоры посевов (культуральной жидкости), в которых при определении промышленной стерильности обнаружены мезофильные клостридии, и необходимо подтверждение присутствия в посевах Cl.perfringens.
Методика. По 1 г подготовленной пробы продукта (или его разведения) вносят параллельно в две чашки Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 450С средой Вильсон-Блера (или сульфит-полимиксин-неомициновый агар), равномерно перемешивают с посевным материалом, а после застывания заливают слоем голодного агара. Чашки выдерживают в анаэробных условиях при 370С в течение 24 ч. Посевы просматривают, отбирают те чашки, в которых выросло от 15 до 150 характерных черных колоний, подсчитывают их количество.
Для подтверждения принадлежности обнаруженных колоний к Cl.perfringens, отбирают не менее 5-ти с характерными признаками и пересевают их в МППБ для мезофильных анаэробных микроорганизмов. Посевы культивируют в термостате 24 ч при 370С и изучают морфологические и биохимические свойства культуры.
Cl.perfringens – крупные грамположительные палочки, расположенные одиночно или в виде коротких цепочек. Споры овальные, расположенные субтерминально. Каталазу не образуют, ферментируют лактозу, разжижают МПЖ, в лакмусовом молоке образуют губчатый сгусток красновато-сиреневого цвета. Для них характерен анаэробный рост.
|
|
|
Выявление ботулинического токсина в консервах. Методика: продукт измельчают, растирают в стерильной ступке до однородной консистенции, добавляя физраствор до соотношения 1:1. Полученную смесь экстрагируют в холодильнике в течение 2 ч. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр, полученный фильтрат переносят в две пробирки по 3 мл, в третью - 2,7 мл фильтрата, в который добавляют 0,3 мл раствора трипсина, устанавливают рН 6,0 и ставят в термостат на 1 ч, периодически перемешивая.
Содержимое первой пробирки оставляют без обработки, а второй – кипятят в водяной бане 10 мин для разрушения ботулинического токсина и охлаждают до комнатной температуры.
Биопробу ставят на белых мышах массой 15-20 г, которым вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл исследуемых фильтратов. Наблюдение за животными проводят через 1,2,4,12ч., далее - 2 раза в день в течение 3 суток. Клинические симптомы ботулинической интоксикации появляются через 10-12 ч, токсином типа Е – через 2-4 ч. При этом у мышей шерсть взъерошена, дыхание затруднено, мышцы брюшной стенки ослаблены и западают («осиная талия»), наблюдаются судороги, паралич задних конечностей. Гибель животных наступает через 4-6 ч, а при высоких концентрациях токсина – в течение 1-2 ч без характерных признаков, в этих случаях биопробу повторяют с разведением исходной жидкости 1:10-1:100.
При наличии в материале ботулинических токсинов вначале болеют и погибают те животные, которым введена необработанная исходная жидкость или обработанная протеолитическим ферментом. Мыши после инъекции прокипяченной жидкости остаются здоровыми на протяжении всего опыта.
Для индикации и определения количества золотистого стафилококка делают посев исследуемых консервов с использованием селективно-диагностических сред по схеме: а) высев навески; б) подсчет колоний с характерными для стафилококка признаками; в) идентификацию выделенных культур. Если в посевах обнаружены грамположительные кокки, способные коагулировать плазму крови, образующие каталазу, ферментирующие мальтозу в анаэробных условиях, то выявленные микроорганизмы относят к Staph. аureus.
|
|
|
При определении потенциальной энтеротоксичности выделенных культур Staph. аureus устанавливают их способность образовывать термостабильную нуклеазу по следующей методике:
- готовят суточную культуру изучаемого стафилококка в МПБ и прогревают ее 15 мин в кипящей бане;
- готовят чашки Петри с МПА содержащим ДНК, асептически вырезают «колодцы» диаметром 4 мм, на расстоянии 7-8 мм друг от друга;
- в эти колодцы вносят по 1-2 капли прогретой бульонной культуры Staph. аureus;
- чашки ставят в термостат, результаты учитывают через 1, 2 и 5 ч. При наличии термостабильной нуклеазы вокруг «колодцев» появляется ярко-розовая зона на синем фоне среды.
Микробиологические показатели консервов в соответствии с Санитарными правилами и нормами представлены в таблице 7.
Таблица 7
Микробиологические нормативы мясных консервов
| Группа продуктов | МАФАнМ КОЕ/г, не более | Масса продукта (г), в которой Масса продукта (г), в которой не допускаются | |||
| БГКП | СРК | S.aureus | Патоген-е МО, в т.ч. сальмонеллы | ||
| Консервы пастеризованные из говядины и свинины | 2х102 | 0,1 | |||
| Консервы стерилизованныеиз говядины и свинины | Должны удовлетворять требованиям промышленной стерильности для консервов группы А |
Задания для самостоятельной работы студентов
1.Провести вскрытие консервной банки, с соблюдением правил асептики взять содержимое банки для бактериологического исследования.
2.Сделать посев пробы для определения МАФАнМ в 1 г консервов.
3.Сделать посев пробы исследуемых консервов в МППБ и среды Вильсон-Блера для обнаружения анаэробных бактерий.
Санитарно-микробиологическое исследование
Колбасных изделий
Цель занятия. Овладеть методами бактериологического исследования колбас и колбасных изделий с целью определения их качества и индикации возбудителей пищевых токсикозов и токсикоинфекций, а также возбудителей порчи.
|
|
|
Материальное оснащение. Образцы вареных и копченых видов колбас. Стерильные чашки Петри, скальпели, ножницы, пинцеты, весы с разновесками, ступки с пестиком, стерильный песок. Чашки Петри с питательными средами – агаром Эндо, Левина, Плоскирева, пробирки со средой Крумвиде-Олькеницкого. Стерильный физраствор в колбах по 90 мл, в пробирках по 9 мл, стерильные пипетки на 1, 10 мл, стерильные мензурки.
Колбасные изделия – продукты переработки мяса, которые употребляют в пищу без дополнительной подготовки, т.к. мясо, используемое для приготовления, подвергают специальной механической, физико-химической и термической обработке. К этим изделиям относятся фаршированные, вареные, полукопченые, варено-копченые, сырокопченые, ливерные и кровяные колбасы, мясные хлебцы, сосиски, сардельки, студни.
Колбасные изделия представляют собой благоприятную среду для развития различных микроорганизмов, вызывающих микробную порчу: термофильных молочнокислых бактерий (закисание), плесневых грибов и протеолитических бацилл (гниение). Быстро портятся варено-копченые и вареные колбасные изделия влажностью более 40-50%, особенно при нарушениях температурно-влажностного режима хранения. В меньшей степени подвержены порче сырокопченые изделия из-за низкого содержания влаги (20-30%).
Степень исходной микробной обсемененности колбасного фарша зависит от санитарно-гигиенических условий производства и соблюдения технологических режимов. В процессе приготовления колбасных изделий, мясной фарш обсеменяется различными микроорганизмами, попадающими в него из вспомогательных материалов: молочные, яичные, мучные продукты, белковые стабилизаторы, посолочные смеси (соль, сахар, нитраты), пряности, лук, чеснок и другие компоненты.
Бактериологическое исследование колбасных изделий направлено на определение количества МАФАнМ, БГКП, индикацию сальмонелл, бактерии родов Proteus, микроорганизмов порчи – в основном это дрожжи и плесневые грибы.
|
|
|
Отбор, подготовка проб и проведение исследования.
Пробы продуктов для микробиологического исследования отбирают раньше проб для физико-химического и органолептического исследования с соблюдением правил асептики, в стерильную посуду, с применением стерильных инструментов. Масса пробы установлена НТД на конкретный вид продукции, достаточной для проведения полного микробиологического анализа.
От кусковой продукции массой нетто до 1000 г отбирают точечные пробы ложкой, пинцетом или другими инструментами в зависимости от вида и размера кусков и помещают в посуду или упаковывают в фольгу. Пробы скоропортящихся продуктов транспортируют при температуре 50С не более 6 часов.
От кусковой продукции массой нетто более 1000 г пробы отбирают одним из следующих методов:
- отрезают или вырезают часть продукта ножом или пилой. У изделий квадратной формы разрез делают перпендикулярно к грани, продольной формы – перпендикулярно к продольной оси;
- продукт в нескольких местах режут ножом и с поверхности разреза и из глубины продукта скальпелем берут необходимое количество кусков, которые пинцетом переносят в стерильную посуду;
- срезают поверхностный слой продукта толщиной от 0,5 до 1 см ножом, при помощи буравчика или зонда и выдавливают продукт в посуду. При отборе пробы из глубины продукта его просверливают в разных местах не менее чем до половины высоты;
Каждую отобранную пробу маркируют этикетками с указанием наименование продукта, предприятия-изготовителя, номера партии, даты отбора продукта, цели микробиологического анализа, подписи лиц, отбиравших пробу. Пробы, предназначенные для исследования вне предприятия, пломбируют, опечатывают и транспортируют в лабораторию.
В зависимости от вида продукта объединенную пробу массой 50 г составляют из точечных проб следующим методом.
Колбасные изделия в оболочке, продукты из говядины, свинины, баранины помещают в эмалированный поддон, тщательно протирают спиртовым тампоном и дважды обжигают над пламенем спиртовки. Затем батоны разрезают продольно стерильным ножом на две половины, не рассекая оболочку противоположной стороны батона. Пробу отбирают из нескольких участков центральной части батона и из-под оболочки обеих его половинок.
Изделия без оболочки (мясные хлебцы, студни и др.) исследуют с поверхности и в глубине. Для этого после развертывания упаковки с каждого из исследуемых образцов делают смыв новым стерильным увлажненным ватным тампоном с тех участков продукта, с которыми могли соприкасаться руки упаковщика. Тампоны помещают в пробирки, заполненные на ¾ одной из сред: ХБ, Хейфеца или Кесслера. Для анализа глубинных участков образцы изделий без оболочки помещают на стерильный эмалированный поддон, смачивают спиртом и обжигают. Делают продольный разрез и отбирают навеску методом, указанным для колбасных изделий в оболочке. Составляют одну объединенную пробу для каждого образца в отдельности и помещают ее в предварительно взвешенную стерильную чашку Петри.
|
|
|
Из объединенной пробы каждого образца берут в стерильную посуду (или пергаментную бумагу) навеску массой 20 г, которую помещают в стерильный стакан гомогенизатора, добавляют 4-кратное количество стерильного физраствора и гомогенизируют в электрическом смесителе (можно магнитной мешалке). Вначале материал измельчают на кусочки при замедленной частоте вращения ножей, затем – при 15000-20000 об/мин в течение 2-3 мин.
При отсутствии гомогенизатора допускается приготовление исследуемой взвеси в ступке. 20 г продукта растирают в стерильной фарфоровой ступке с 2-3 г речного песка, постепенно приливая 80 мл стерильного физраствора.
В том и другом случае в 1 мл приготовленной взвеси содержится 0,2 г исследуемого продукта.
Взвесь 15 мин выдерживают при комнатной температуре и делают высев для определения количества МАФАнМ, БГКП, бактерий рода сальмонелла и протея, сульфитредуцирующих клостридий.
Методика определения МАФАнМ. Из каждой пробы колбасных изделий делают не менее двух различных по объему посевов, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. В одну чашку Петри вносят 0,1 г, а в другую – 0,01 г продукта.
Предварительно готовят первое 10-ти кратное разведение исследуемой взвеси. Стерильной пипеткой 5 мл исследуемой взвеси переносят в пробирку с 5 мл стерильного физраствора. Другой стерильной пипеткой содержимое пробирки тщательно перемешивают продуванием, набирают 1 мл и вносят в стерильную чашку Петри (т.е. провели посев 0,1 г продукта).
Для посева 0,01 г продукта готовят второе разведение - 1:100: для этого стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки с первым разведением, набирают 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильного физраствора (теперь в 1 мл содержится 0,01 г исследуемого продукта). 1 мл такого разведения вносят в чашку Петри. Обе чашки заливают 15 мл МПА, расплавленного и охлажденного до 450С, перемешивают тщательно, чтобы выросли изолированные колонии. После застывания агара чашки помещают в термостат при 370С, через 48 ч подсчитывают общее количество колоний, выросших на поверхности и в глубине агара, умножают на степень разведения исследуемого продукта по каждой чашке и выводят среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек с разной массой посеянного продукта.
Методика индикации БГКП. Цель индикации бактерий этой группы – проверка соблюдения режима термической обработки колбас или санитарно-гигиенических условий в процессе производства сырокопченых колбасных изделий. Исследование на БГКП проводят по общепринятой методике с использованием сред, содержащих углеводы (лактоза, глюкоза). К ним относятся среды Хейфеца, ХБ, Кода, Кесслера. БГКП ферментируют глюкозу и лактозу, поэтому в перечисленных средах образуются кислые продукты, меняющие цвет индикатора, а в среде Кесслера можно наблюдать появление в поплавках пузырьков газа.
При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиться обнаружением БГКП без их биохимической дифференциации. Для выявления БГКП в пробирки с 5 мл среды ХБ или Хейфеца двойной концентрации вносят по 5 мл исследуемой взвеси стерильной пипеткой с широким концом. Допускается применение среды Кесслера по 10 мл. Посевы термостатируют при 370С в течение 18-20 ч. Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 430С (для обнаружения повторного бактериального загрязнения). При росте БГКП среда ХБ окрашивается в желтый цвет, среда Хейфеца – в салатно-зеленый, на среде Кесслера в поплавках образуется газ.
Для окончательного заключения о присутствии в колбасе БГКП проводят высев со среды Кесслера (из забродивших проб) или Хейфеца (если произошло изменение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо (Плоскирева, Левина) и помещают в термостат при 370С на 18-20 ч. На среде Эндо БГКП образуют темно-красные колонии с металлическим блеском, на среде Плоскирева – кирпично-красные, на среде Левина – темно-фиолетовые колонии. Из подозреваемых колоний готовят мазки, окрашивают по Граму – обнаруживают грамотрицательные палочки.
Обнаружение коротких с закругленными концами грамотрицательных палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие БГКП.
Среды для определения бактерий группы кишечнеых палочек.
Среда Хейфеца – выпускается в сухом виде. В состав, кроме основных питательных компонентов (вода, пептон, маннит, натрия хлорид) входят розоловая кислота, раствор метиленового синего. Готовая среда красно-фиолетового цвета, при росте кишечной палочки рН сдвигается в кислую сторону, и среда приобретает зеленоватую окраску
«ХБ» (хинозолбромкрезолпурпурная среда). В 1 л воды растворяют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г маннита. Приготовленную смесь кипятят 15-20 мин, устанавливают рН 7,4-7,6, фильтруют через бумажный фильтр, кипятят фильтрат 10 мин, охлаждают до 60С, после чего прибавляют 30 мл дрожжевого диализата, 15 мл желчи, 10 мл раствора хинозола и 10 мл 1,6% спиртового раствора бромкрезола пурпурного. Среду разливают в стерильные пробирки по 7-8 мл.
Среда Кесслера
К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании 20-30 мин, фильтруют через вату, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем дистиллированной воды до 1000 мл, устанавливают рН 7.4-7.6, добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора генциан-виолета, разливают в пробирки с поплавками по 8-10 мл и стерилизуют при температуре 1210С в течение 10 мин. Готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет.
Индикация сальмонелл. Навеску колбасы массой 25 г от объединенной пробы, тщательно измельченной ножницами, вносят во флакон, содержащий 100 мл среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористо-магниевой) или 225 мл селенитового бульона. Флакон встряхивают и ставят в термостат при 370С на 24 ч. Затем петлей или пастеровской пипеткой проводят высев из среды обогащения в чашки Петри со средой Эндо, Плоскирева, Левина или ВСА. Посевы помещают в термостат при 370С на 16-24 ч.
На среде Эндо, Плоскирева и Левина бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные колонии. На ВСА сальмонеллы образуют черные или коричневые колонии с металлическим блеском, при этом участок среды под агаром чернеет. Не менее 5-ти изолированных колоний, характерных для сальмонелл, пересевают на трехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик и инкубируют при 370С в течение 12-16 ч.
При росте сальмонелл на трехсахарном агаре цвет скошенной поверхности среды розовый, столбик желто-бурый. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при образовании сероводорода питательная среда чернеет.
Другие грамотрицательные бактерии семейства энтеробактерий дают следующие изменения цвета трехсахарного агара:
- БГКП на трехсахарном агаре вызывают окрашивание среды в синий или сине-зеленый с образованием газа или без него;
- палочка протея вызывает окрашивание среды в ярко-красный цвет (вследствие расщепления мочевины), в случае выделения Н2S может появиться черный осадок с возможным разрывом агара.
Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют, а также изучают антигенные свойства путем постановки РА на предметном стекле с поливалентной (или комплексной) сальмонеллезной агглютинирующей сывороткой. Далее проводят идентификацию с помощью монорецепторных О- и Н-агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.
Обнаружение подвижных (кроме S.pullorum и S.gallinarum), грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, сбраживающих глюкозу и манит до кислоты и газа (S. typhi suis маннит неферментирует), образующих Н2S и не образующих индол, дающих положительную реакцию агглютинации с комплексными, монорецепторными О- и Н-агглютинирующими сальмонеллезными сыворотками, указывает на выделение бактерий из рода сальмонелл.
Индикация протея в Н-форме проводится внесением исследуемого продукта в конденсат свежескошенного МПА (метод Щукевича). Посевы помещают в термостат на 18-24 ч при 370С. При наличии в исследуемом продукте протея, подвижная палочка поднимается вверх, по скошенной поверхности агара, образуя вуалеобразный голубоватый налет. Культура издает характерный гнилостный запах.
Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, подвижных, сбраживающих глюкозу и мочевину, неферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий из рода протея.
Индикация стафилококка в исследуемом продукте основана на изучении морфологии, культуральных свойств и способности некоторых стафилококков ферментировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
Вначале исследуемый продукт разводят 1:10, вносят в МПБ, содержащий 6,5% натрия хлорида. После инкубирования в термостате проводят пересев на молочно-солевой агар для изучения наличия пигмента и на желточно-солевой агар для выявления лецитиназной активности.
Посевы выдерживают 24 часа в термостате и сутки при комнатной температуре, затем учитывают результат: на поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид слегка выпуклых круглых колоний с ровными краями; на желточно-солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенности (лецитиназная активность).
Не менее чем из 5-ти типичных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму. При наличии стафилококков обнаруживают грамположительные кокки, располагающиеся в виде кучек и гроздьев винограда.
Для подтверждения патогенности выделенных стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции по методике: в пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы крови кролика, разведенной физраствором (1:5) вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при 370С. Реакцию плазмокоагуляции предварительно учитывают через 3-4 часа (осторожно, не встряхивая пробирку). В сомнительных случаях пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Реакцию считают положительной, если плазма коагулирует в сгусток (реакцию оценивают по степени плотности сгустка от одного до четырех плюсов).
Индикация сульфитредуцирующих клостридий (СРК) в колбасе основана на учете специфического роста клостридий в железосульфитсодержащих средах. При взаимодействии натрия сульфита с хлоридом железа образуется сульфат железа, который вызывает почернение питательной среды.
Для выявления СРК 1 мл исследуемой взвеси стерильной пипеткой вносят в пробирку с 9 мл жидкой сульфит-циклосериновой среды или среды Вильсон-Блера. Затем проводят последовательные пересевы на аналогичные объемы среды и получают возрастающие 10-ти кратные разведения суспензии. Посевы выдерживают 18-20 ч при 370С, при наличии СРК среда чернеет.
Для подтверждения принадлежности выделенных культур к клостридиям проводят пересев на поверхность агаризованной плотной среды Вильсон-Блера и инкубируют в анаэробных условиях при 370С в течение 24-48 ч. Отбирают типичные колонии и изучают микроорганизмы по морфологическим и некоторым культурально-биохимическим свойствам, в частности по отрицательной реакции на каталазу.
Если в посевах (в 4 колониях из 5) обнаружены СРК, грамположительные, нередко спорообразующие палочки, каталазоотрицательные, способные расти в анаэробных условиях, то делают заключение о наличии в продукте СРК по максимальному разведению суспензии, в посеве которого наблюдается почернение среды. Например, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10-1, то считают, что в 1 г исследуемого продукта содержится 10 клеток, при аналогичных изменениях в пробирках с разведением 10-2 - 100 клеток.
При получении неудовлетворительных результатов микробиологического анализа готовой продукции, по требованию контролирующих организаций и постоянно при входном контроле проводят исследование вспомогательных материалов.
Микробиологические показатели колбасных изделий и продуктов из мяса регламентированные Санитарными правилами и нормами представлены в таблице 8.
Таблица 8
Микробиологические нормативы колбасных
изделий и продуктов из мяса животных и птиц
| Группа продуктов | МАФАнМ КОЕ/г, не более | Масса продукта (г), в которой не не допускается наличие | |||
| БГКП | СРК | S.aureus | Патогенных микроор-в,в т.ч.Salmonell | ||
| 6 | |||||
| Колбаса сырокопченая | - | 0,1 | 0,01 | ||
| Вареные колбас. изделия, сардельки, сосиски: - высшего и 1 сорта - 2-го сорта | 1.103 2,5. 103 | 0,01 0,01 |
|
|
|
