Рис. 22 Спектрограмма, полученная в результате секвенирования по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе

Рис. 22 Спектрограмма, полученная в результате секвенирования по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе

Анализ данных капиллярного секвенирования сводится к " прочтению" последовательных пиков флуоресценции. В настоящее время, с использованием современных автоматических секвенаторов, длина одного прочтения по методу Сэнгера составляет 800-1000 нуклеотидов.

2. 3 Метод гибридизации на твердой фазе

В конце 1980-х был предложен подход к определению последовательностей ДНК, получивший название " секвенирование путем гибридизации" (sequencing by hybridization, SBH) или секвенирования на чипе. Метод основан на гибридизации меченных флуоресцентными метками одноцепочечных фрагментов ДНК с синтетическими олигонуклеотидами известной структуры и длины, которые точечно расположены на твердой основе. При этом на подложке присутствуют все возможные варианты последовательности олигонуклеотида заданной длины. Например, для олигонуклеотида длиной в 8 оснований будут возможны 4⁸=65 536 вариантов последовательностей. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы только полностью комплементарные фрагменты ДНК взаимодействовали с олигонуклеотидом на подложке.

Рис. 23 Принцип метода секвенирования на чипе

После удаления несвязавшихся молекул ДНК можно зарегистрировать сигнал флуоресценции в тех участках чипа, где находится олигонуклеотид, комплементарная последовательность которого есть в секвенируемом образце ДНК. Полученный гибридизационный паттерн можно использовать для восстановления исходной последовательности путем сборки перекрывающихся участков сработавших проб (Рис. 23).

К сожалению, невозможно подобрать условия, при которых с олигонуклеотидами будут гибридизоваться только полностью комплементарные фрагменты. Всегда находятся GC-богатые участки, которые будут гибридизоваться и при наличии одного или даже нескольких неспаренных оснований. В связи с этим, метод SBH пока не нашел широкого практического применения. Тем не менее, алгоритмы, разработанные на основе SBH для сборки коротких прочтений в более длинные фрагменты, стали основой для последующих алгоритмов высокоскоростной сборки и выравнивания, используемых с технологиях секвенирования нового поколения (new generation sequencing, NGS).

2. 4 Секвенирование с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Matrix-assistedlaserdesorption/ionization-time-of-flight) (определение нуклеотида по массе и заряду)

Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать компоненты гетерогенной смеси биомолекул по разнице их молекулярных масс. В варианте MALDI-TOF, образец для анализа помещают на поглощающую УФ-излучение подложку и подвергают воздействию короткого лазерного импульса. Ионизированные молекулы летят в электрическом поле в направлении детектора, причем время, за которое частица достигает детектора обратно пропорционально отношению масса/заряд.

Для определения последовательности нуклеотидов ДНК методом MALDI-TOF гомогенный фрагмент ДНК (или РНК) высушивают на поверхности в среде 3-гидроксипиколиновой кислоты. ДНК обрабатывают коротким импульсом УФ-лазера, в результате чего ионы ДНК переходят в газовую фазу.