2.10 Секвенирование генома человека

2. 10 Секвенирование генома человека

Создание автоматических секвенаторов настолько упростило и удешевило процесс определения последовательности ДНК, что позволило к середине 1980-х годов говорить о возможности определить полную последовательность генома человека, что вылилось в крупнейшее исследование под названием Human Genome Project (HGP) (Проект " Геном человека" ). Целью проекта, кроме определения последовательности нуклеотидов, была также идентификация всех генов человека. Проект стартовал в 1990 г. и финишировал в 2001 г. публикацией в журнале Nature. Однако полный анализ полученных данных был завершен только в 2004 г. Стоит отметить, что в 1998 г., параллельно с мировым научным сообществом, секвенированием генома человека занялась компания Celera. Полная последовательность нуклеотидов генома человека (3х10⁹ п. н. ) была получена ее сотрудниками в течение 9 месяцев, т. е. в 20 раз быстрее, чем участниками консорциума HGP. Получение столь быстрых результатов, среди прочего, было связано с тем, что Celera стартовала на автоматических секвенаторах последнего поколения, сильно выигрывавших по производительности. Кроме того, это позволило сотрудникам Celera не прибегать к клонированию генома в искусственных бактериальных хромосомах (bacterial artificial chromosomes, BAC), а сразу применить " метод дробовика" для всего генома.

Основная сложность данной задачи состояла в том, что имевшиеся в то время в распоряжении исследователей секвенаторы ДНК позволяли секвенировать лишь несколько сотен нуклеотидов за одно прочтение. Решение данной проблемы состояло в том, чтобы разбить геном на фрагменты и секвенировать затем каждый фрагмент по отдельности. Однако, главная проблема состояла также в том, как соединить последовательности коротких фрагментов в правильном порядке, чтобы получить сначала последовательности отдельных хромосом, а потом и весь геном. Для решения этой задачи были применены две стратегии: шутган-секвенигование (shotgun) или метод " дробовика" и секвенирование по принципу " клон за клоном" (clone-by-clone).

Метод " дробовика" состоял в том, чтобы разбить геном на небольшие фрагменты, определить их нуклеотидную последовательность, а затем при помощи мощного суперкомпьютера восстановить исходную последовательность на основании перекрывающихся участков (Рис. 31).

Рис. 31 Принцип секвенирования методом " дробовика"

Однако, такой подход может быть успешно применён лишь для секвенирования относительно небольших геномов. Данный метод показал свою эффективность в 1995 г., когда был секвенирован геном бактерии Haemophilus influenzae, первого организма, последовательность генома которого была установлена. Недостатком метода является то, что сборка генома может быть сильно осложнена повторяющимися нуклеотидными последовательностями (Рис. 32).

Рис. 32 Повторяющиеся участки затрудняют правильную сборку последовательности

У эукариот, в особенности у позвоночных, такие повторяющиеся последовательности составляют довольно большую часть генома.

Данную проблему удалось преодолеть путем совмещения метода " дробовика" с подходом " клон за клоном". Вначале была создана геномная библиотека. Геном человека разбили на перекрывающиеся фрагменты длиной 100-200 тыс. п. н. Затем эти фрагменты лигировали в искусственные бактериальные хромосомы (bacterial artificial chromosomes, BAC), которые внедрили в клетки E. coli. BAC похожи на бактериальные плазмиды, но, в отличие от них, они могут включать гораздо большие фрагменты ДНК. Бактерии делились и копировали BAC, производя коллекцию перекрывающихся клонированных фрагментов.

Затем было найдено местоположение каждого из этих фрагментов в геноме человека. Для этого была составлена рестрикционная карта каждого из клонов (Рис. 33).