1.3.1.2 Специфические системы детекции

1. 3. 1. 2. 1 Праймеры-пробы (" скорпионы" )

В основе данного методы лежит идея объединения праймера и гибридизационной пробы в одну молекулу. Для этого к 5ʹ -концу праймера прикрепляется адаптер со структурой типа " стебель-петля", в котором петлевая часть адаптерной шпильки комплементарна внутренней части образующегося фрагмента (Рис. 11). Эта структура практически полностью повторяет праймеры типа " амплифлюр" с той лишь разницей, что адаптер отделен от праймера блокатором синтеза второй цепи ДНК во избежание его удвоения.

Рис. 11 Схема работы праймеров-скорпионов

Таким образом, после образования продукта реакции, петлевая часть адаптерной последовательности может гибридизоваться на внутреннюю часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя флуоресценции и, как следствие, у усилению сигнала.

1. 3. 1. 2. 2 Линейные разрушаемые пробы (TaqMan)

В данном подходе, олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР, метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизуется на ампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5ʹ -экзонуклеазной активности Taq-полимеразы (Рис. 12).

Рис. 12 Схема действия механизма TaqMan

При этом интенсивность сигнала нарастает пропорционально увеличению количества ампликонов. В данном подходе, принципиальным моментом является использование ДНК-полимераз с хорошо выраженной 5ʹ -экзонуклеазной активностью.

1. 3. 1. 2. 3 Пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные " маячки", molecular beacons)

В данной методике флуорофор и гаситель располагают на противоположных концах олигонуклеотида. Зонды, находящиеся в растворе при температуре ниже 55-60°С образуют структуру типа " стебель-петля" с очень низким уровнем флуоресценции. При гибридизации с ампликоном зонд разворачивается, что ведет к увеличению уровня флуоресценции (Рис. 13).

Рис. 13 Схема работы молекулярных " маячков"

1. 3. 1. 2. 4 Метки, работающие на основе метода флуоресцентного резонансного переноса энергии (fluorescent resonance energy transfer, FRET).

В данной методике используются 2 олигонуклеотидных зонда, каждый из которых помечен своим флуорофором, один из которых имеет максимум поглощения в более коротковолновой, а другой в более длинноволновой части спектра. Метки подбираются таким образом, чтобы максимум эмиссии флуорофора с более коротковолновым максимумом поглощения был близок к максимуму поглощения второго флуорофора. Таким образом, один зонд несет флуорофор-донор, а другой - флуорофор-акцептор флуоресценции. Последовательность зондов задается таким образом, чтобы они могли гибридизоваться с матричной ДНК в непосредственной близости друг от друга. Гибридизация двух зондов с матрицей ведет к сближению флуорофоров и к туннельному переносу энергии с донора на акцептор (Рис. 14). Детекцию продуктов амплификации ведут посредством регистрации флуоресценции флуорофора-акцептора при длине волны возбуждения флуорофора-донора. Данный подход наиболее широко используется при анализе однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms, SNPs).