Рис. 26 Принцип метода пиросеквенирования

Рис. 26 Принцип метода пиросеквенирования

Ферментативные реакции осуществляются АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой. Также в месте с ними в ячейке присутствуют аденозинфосфосульфат (APS) и люциферин. Выделяющийся в ходе образования очередной фосфодиэфирной связи пирофосфат вступает в реакцию с APS, катализируемую АТФ-сульфурилазой, с образованием АТФ. Образовавшийся АТФ является источником энергии для люциферазной реакции окисления люциферина в оксилюциферин, в процессе которой генерируются кванты света в видимой области спектра, в количестве, пропорциональном количеству включенных в растущую цепь ДНК нуклеотидов. Световой сигнал регистрируется ПЗС-матрицей (подобной тем, которые используются в обычных цифровых фотоаппаратах) и анализируется при помощи программного обеспечения, преобразующего так называемую пирограмму в последовательность нуклеотидов (Рис. 26).

Не вовлеченные в синтез новой цепи нуклеотиды, а также АТФ деградируются при помощи апиразы. После этого можно начинать следующий цикл, т. е. добавлять другой тип нуклеотида. На принципе пиросеквенирования основана коммерческая технология 454 Life Sciences Roche.

2. 7 Метод обратимых терминирующих нуклеотидов (регистрация каждого присоединенного нуклеотида по отщепляемой метке)

Данная концепция была предложена Баласубрамяном и Кленерманом на химическом факультете Кембриджского университета. Также как и при пиросеквенировании, принцип метода состоит в регистрации факта присоединения очередного нуклеотида, но не по побочным продуктам реакции, а непосредственно по сигналу от присоединенного основания. При этом должны выполняться два требования:

1) за один цикл реакции может быть добавлен только один нуклеотид. Это легко обеспечить с использованием 3ʹ -блокированных dNTP с возможностью снятия блока.

2) метка должна быть отщепляемой.

Сначала любым методом создают иммобилизованную на твердой фазе клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК (например, методом мостиковой или эмульсионной ПЦР). Секвенирование начинают с отжига праймера, комплементарного адаптеру на одном из концов библиотеки ДНК. Затем к библиотеке добавляют четыре типа флуоресцентно меченых обратимых терминирующих dNTP (так называемых RT-оснований). ДНК-полимераза присоединяет подходящий нуклеотид к затравке и на этом синтез временно останавливается.

Рис. 27 Принцип секвенирования синтезом клональной библиотеки одноцепочечных фрагментов ДНК на твердой фазе

Невключившиеся нуклеотиды смывают, и оптическая система считывает флуоресценцию каждой ДНК-колонии библиотеки. Каждая колония высвечивает при этом кванты флуоресценции, соответствующие включившемуся на данном этапе нуклеотиду. После этого флуорофор, наряду с 3ʹ -концевым блокатором, химически удаляют из синтезированной цепи, что позволяет повторить весь цикл сначала (Рис. 27).

В отличие от пиросеквенирования в данном подходе сигнал флуоресценции можно регистрировать в течение длительного времени после присоединения очередного нуклеотида, что позволяет производить анализ очень большого количества ДНК-колоний.

На данном принципе секвенирования основаны коммерческие технологии компаний Illumina и Pacific Bioscience.