 |
1.5 Эмульсионная ПЦР (emulsion PCR, ePCR)
|
|
|
|
1. 5 Эмульсионная ПЦР (emulsion PCR, ePCR)
Эмульсионная ПЦР представляет собой распространенный вариант клонирования фрагментов ДНК in vitro. Эта методика позволяет амплифицировать ДНК на покрытых праймерами микросферах, так что каждая микросфера оказывается " облеплена" фрагментами только одного типа. Для этого создают библиотеку фрагментов ДНК с адаптерами по концам, а затем смешивают полученные фрагменты с покрытыми праймерами микрофсерами, свободным праймером, и остальными необходимыми для ПЦР компонентами в условиях мелкодисперсной водно-масляной эмульсии так, чтобы в каждую микрокаплю воды попали в среднем одна микросфера и один " стартовый" фрагмент ДНК. В ходе ПЦР, праймеры на микросфере инициируют синтез фрагментов, начиная с единственной матрицы, а с праймера, находящегося в растворе, достраивается вторая цепь. В итоге получают миллионы микросфер, каждая из которых несет миллионы идентичных фрагментов ДНК (Рис. 16).
Рис. 16 Принцип действия эмульсионной ПЦР
Для оценки качества библиотеки, полученной с помощью эмульсионной капельной ПЦР исходят из правила, что соотношение числа " сработавших" микросфер к " несработавшим" должно быть примерно 30/70. Оценить количество сработавших микросфер можно посредством измерения флуоресценции несущих ДНК микросфер относительно несработавших. Для этого применяется набор реагентов Ion Sphere Quality Control Kit (Life Technologies, Thermo Fisher).
1. 6 Цифровая капельная ПЦР (цПЦР, ddPCR)
Цифровая полимеразная цепная реакция (цПЦР) - это технологически усовершенствованный метод традиционной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип цифровой ПЦР заключается в том, что реакционная смесь после добавления образца делится на десятки тысяч микрообъемов, в каждом из которых проходит независимая ПЦР (Рис. 17).
|
|
|
Рис. 17 Принцип работы цифровой капельной ПЦР
Это позволяет проводить амплификацию молекул ДНК и идентифицировать ПЦР-продукты, полученные с каждой отдельной ДНК-матрицы, при этом не требуются использовать стандарты. Данный метод незаменим для решения таких задач, как определение редких последовательностей ДНК, например, соматических мутаций клеток опухолей в парафинизированных гистологических срезах и биоптатах, даже при низком количестве целевой ДНК, выявление наличия циркулирующих опухолевых клеток в очень небольшом титре у пациентов, высокоточное определение количества копий гена, анализ экспрессии генов и miRNA единичных клеток в неоднородных популяциях, оценка качества приготовления образцов для высокопроизводительного секвенирования (секвенирования нового поколения, new generation sequencing, NGS) для улучшения качества результатов сиквенса, выявление загрязнения даже единичными бактериальными клетками или вирусными частицами.
Преимуществами цифровой ПЦР по сравнению с ПЦР в реальном времени являются:
- прямое обнаружение редкого варианта мишени в сложном окружении;
- исключительная чувствительность и точность даже при анализе единичных молекул ДНК;
- отсутствие калибровочных кривых и отсутствие эффекта первых циклов ПЦР;
- низкая чувствительность к присутствию ингибиторов.
|
|
|
