Рис. 33 Расположение индивидуальных клонов фрагментов генома, содержащихся в BAC, на физической карте генома определяется при помощи их рестрикционных карт.

Рис. 33 Расположение индивидуальных клонов фрагментов генома, содержащихся в BAC, на физической карте генома определяется при помощи их рестрикционных карт.

Знание расположения сайтов рестрикции в каждом из клонов позволило определить их местоположение на рестрикционной карте генома человека. Зная относительное расположение клонированных фрагментов, исследователи выбрали из них около 30 000, разрезали на небольшие фрагменты с помощью рестриктаз и секвенировали по методу " дробовика". После этого стало возможным собрать последовательность всего генома, соединяя между собой последовательности отдельных клонов, покрывающих всю длину генома.

3. Генная терапия

Генная терапия, в широком смысле, означает лечение путем введения в ткани или клетки пациента смысловых последовательностей ДНК. Первоначально генная терапия рассматривалась как возможность исправления дефекта в гене с целью лечения моногенных наследственных заболеваний (МНЗ). Предполагалось, что теоретически такая коррекция будет возможной как на соматическом уровне, так и на уровне половых клеток. Однако, многочисленные исследования в данной области показали, что значительно проще исправлять не сам дефект в гене, а вести коррекцию путем введения в организм пациента полноценно работающего гена. Несмотря на значительные успехи генной инженерии, исследования по генной терапии у человека осуществляются исключительно на соматических клетках, в которых происходит экспрессия дефектного гена. Генная терапия на уровне половых и зародышевых клеток человека, ввиду возможных серьезных последствий для генофонда человечества, представляется на современном этапе весьма проблематичной и малореальной. Разработанная на сегодняшний день и применяемая на практике методология генной терапии оказалась пригодной для лечения не только МНЗ, но и онкозаболеваний, тяжелых вирусных инфекций, сердечно-сосудистых заболеваний и др. Поэтому, на современном этапе, генную терапию можно определить как лечение наследственных, онкологических, некоторых вирусных и других заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов либо придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 г. с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы прокариотическим геном neo. Первым МНЗ, в отношении которого были применены методы генной терапии был наследственный иммунодифицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). К другим МНЗ, в отношении которых уже имеются официально разрешенные протоколы и начаты клинические испытания, относятся семейная гиперхолестеролемия, гемофилии А и В, муковисцидоз, болезнь Гоше и некоторые другие.

3. 1 Типы генотерапевтических вмешательств и выбор клеток-мишеней

Генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мишени. Она проводится либо с целью коррекции наследственной патологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания этим клеткам новых функций, способствующих устранению патологических процессов. В первом случае в организм пациента вводят нормально работающий гомолог дефектного гена. Второй подход применяют для лечения онкологических и инфекционных заболеваний. В этих случаях вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или способствующие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для таких генов могут служить пораженные ткани, иммунные клетки, специфическим образом проникающие в эти ткани, либо предварительно трансформированные in vitro другие клетки. В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная терапия (ex vivo) предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту. В настоящее время, большинство допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии используют подход ex vivo. Генная терапия ex vivo включает следующие этапы (Рис. 34):

1) получение клеток от больного;

2) исправление генетического дефекта с помощью переноса нужного гена в изолированные клетки;

3) отбор и наращивание генетически " исправленных" клеток;

4) инфузия или трансплантация этих клеток пациенту;