Материалы и методы исследования

 

 

Общая часть.

 

С 1995г по 2006г были собраны данные о 160 пациентах с ВКЛ в возрасте от 27 до 83 лет (57 женщин, 103 мужчин). В исследование были включены больные, наблюдавшиеся в Гематологическом научном центре РАМН (отделения химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии, консультативно-поликлиническое, хирургическое, стационар дневного пребывания), городской клинической больницы N40 (отделение гематологии), городской клинической больницы N60 (отделение терапии), института биофизики (отделение гематологии).

Больных включали в исследование после верификации диагноза ВКЛ морфологическим исследованием лимфоцитов крови и костного мозга (заведующая лабораторией клинической морфологии – Л.Ю.Тихонова), цитохимическим исследованием лимфоцитов лейкоконцентрата и/или костного мозга на тартрат-устойчивую кислую фосфатазу (заведующий лабораторией гемоцитологии - д.м.н. Г.И.Козинец), гистологическим исследованием биоптата костного мозга или селезенки (руководитель патологоанатомического отделения – член-корр РАМН проф.Г.А.Франк), иммунофенотипическим исследованием лимфоцитов крови и/или костного мозга (заведующая лабораторией клинической иммунологии – профессор, д.м.н. Т.И.Булычева, заведующий лабораторией функциональной морфологии гемобластозов – д.б.н. И.А.Воробьев). При невозможности проведения иммунофенотипического исследования на начальном этапе диагностики выполняли иммуногистохимическое исследование трепанобиоптата по блокам (заведующая патологоанатомическим отделением – к.м.н. И.Б.Капланская).

 

Основные понятия.

Под типичной формой ВКЛ подразумевали типичную клиническую картину (цитопения с абсолютным лимфоцитозом и моноцитопенией, спленомегалия разной степени выраженности). Лейкопению считали определяющей в отнесении заболевания к типичной форме (количество лейкоцитов < 4х10⁹/л).

Цитопения включала в себя одно-, двухростковую и панцитопению. Лейкопенией считали уровень лейкоцитов менее 4х10⁹/л, нейтропенией – число нейтрофилов менее 1.5х10⁹/л, моноцитопенией – число моноцитов менее 3%. Анемией считали уровень гемоглобина менее 120 г/л. Тромбоцитопенией считали количество тромбоцитов менее 150х10⁹/л.

Под вариантной формой ВКЛ подразумевали ту же клиническую и лабораторную картину, но без лейкопении. Характерным для вариантной формы было нормальное (4-10х10⁹/л) или повышенное (>10х10⁹/л) количество лейкоцитов.

Характерными для ВКЛ считали выявление в крови и/или костном мозге, селезенке «ВК» с фенотипом поздних зрелых активированных В-лимфоцитов, экспрессирующие CD19⁺, CD20⁺, CD22⁺, CD23-, CD5-, CD10-, CD103⁺, CD11c⁺, CD25⁺, FMC7⁺, CD85⁺, HC2⁺, анти-ВКЛ⁺.

«ВК» с аберрантным фенотипом считали клетки со слабой экспрессией или отсутствием экспрессии любого из характерных для ВКЛ маркеров (CD103, CD11c, CD25, FMC7, CD85, HC2, анти-ВКЛ), или экспрессирующие другие, нехарактерные для ВКЛ, маркеры (СD5, CD10, CD23).

Под полной ремиссией (ПР) подразумевали:

1. Нормализация размеров селезенки и лимфоузлов.

2. Отсутствие в крови «волосатых клеток».

3. < 5% «волосатых клеток» в костном мозге.

4. Гемоглобин ≥120г/л.

5. Нейтрофилы >1,5х10⁹/л.

6. Тромбоциты >100х10⁹/л.

За частичную ремиссию (ЧР) принимали:

1. Уменьшение размеров селезенки и лимфоузлов >50%.

2. В крови < 5% «волосатых клеток».

3. Уменьшение «волосатых клеток» в костном мозге > 50%.

4. Нв ≥120г/л.

5. Нейтрофилы >1,5х10⁹/л.

6. Тромбоциты >100х10⁹/л.

Улучшением считали нормализацию одного из параметров без ухудшения других.

Рефрактерностью к лечению считали отсутствие вышеуказанных критериев ремиссии или улучшения.

Рецидивом считали появление хотя бы одного клинического признака (цитопения, спленомегалия) с появлением «волосатых клеток» в крови и/или костном мозге, или только появление ранее исчезнувших «волосатых клеток» в крови и/или костном мозге.

 

Протокол обследования больного волосатоклеточным лейкозом.

Предложен протокол обследования первичного больного с диагнозом волосатоклеточного лейкоза (Приложение, схема 1), включающий в себя: опрос больного и физикальный осмотр; рутинные лабораторные исследования, ЭКГ, рентгенография грудной клетки, УЗИ брюшной полости; специальные лабораторные исследования – миелограмма, трепанобиопсия c гистологическим и иммуногистохимическим исследованием костного мозга, иммунохимическое исследование сыворотки крови и мочи, цитохимическое исследование лимфоцитов лейкоконцентрата и/или костного мозга на тартрат-устойчивую кислую фосфатазу, иммунофенотипирование лимфоцитов крови и/или костного мозга, кариологическое исследование костного мозга.

Для больных из других лечебных учреждений были проведены дополнительные исследования и обработаны имеющиеся данные.

Методики исследований.

I. Рутинные исследования.

1. Цитологическое исследование мазков периферической крови и костного мозга проводилось в клинико-диагностической лаборатории ГНЦ РАМН (зав. лабораторией – к.м.н. Л.Ю.Тихонова). Использовались стандартные методы фиксации и окраски.

2. Гистологическое исследование костного мозга (трепанобиопсия) проводилось в патологоанатомическом отделении ГНЦ РАМН (руководитель – член-корр. РАМН, проф. Г.А.Франк). Гистологическое исследование выполнялось на срезах толщиной 3-5 мкм, окрашенных гематоксилин-эозином. Иммуногистохимическое исследование (в.н.с., к.м.н. И.Б.Капланская) выполняли на срезах толщиной 3-5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые L-полилизином. Использовался авидин-биотин-пероксидазный метод с панелью моноклональных и поликлональных антител к: CD21, CD21, CD45RO, CD43, CD3, CD79a, CD5, Cyclin D1, bcl-2, Ki-67, CD25, DBA.44.

 

II. Специальные исследования.

1. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили в лаборатории клинической иммунологии (зав. лабораторией – профессор, д.м.н. Т.И.Булычева, в.н.с. лаборатории к.б.н. Р.С.Самойлова). Во всех включенных в анализ случаях определялись общие В-клеточные маркеры CD19, CD20, CD22, клональность В-лимфоцитов по легким цепям Ig каппа (k) и лямбда (λ), специфические для ВКЛ антигены CD103, анти-ВКЛ, CD85, НС2, активационные антигены CD11c, CD25, CD38 и прочие дифференциально-диагностические антигены - FMC7, CD10, CD23, CD5. Лимфоциты крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фекола. Выделенные лимфоидные клетки трижды отмывались холодным 0,9% раствором NaCl с 0,01М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 (PBS).

Методика непрямого иммунофлюорисцентного маркирования мембранных антигенов: концентрацию опухолевых клеток в суспензии доводили до 4-5 млн./мл. По 100 мкл суспензии опухолевых клеток в данной концентрации вносили в 96-луночные круглодонные плашки. Клетки осаждали путем центрифугирования 300g – 5 мин. После удаления надосадочной жидкости, согласно выбранной панели антител, в каждую лунку вносили по 20 мкл немеченых мышиных моноклональных антител в заранее отработанном рабочем разведении в PBS с 1% добавкой бычьего сывороточного альбумина (БСА) для блокирования неспецифического связывания антител. В контрольные лунки вместо вместо моноклональных антител вносили 20 мкл среды: 0,01М PBS pH 7,4 – 100мл, БСА – 1г (1%), прогретая эмбриональная телячья сыворотка – 2% (v/v), NaN₃ до 0,1%. Инкубировали 30 мин при t+4^о. Далее, после 2-кратной отмывки холодным PBS, наносили F(ab)₂-фрагменты поликлональных козьих антител против мышиных иммуноглобулинов, коньюгированных с флюоресцин-изотиоцианатом (FITC), в в подобранном рабочем разведении. Инкубировали 30 мин при t+4^о с последующей 3-кратной отмывкой. 8-луночные предметные стекла (Flow, Великобритания) покрывали 15-20мкл раствора L-полилизина 25 мкг/мл на физ. растворе (Sigma, США), для чего их инкубировали во влажной камере в течение 30 мин., перед нанесением клеточной суспензии стекла промывали PBS. После последней отмывки клетки ресуспендировали в 50 мкл PBS, 25 мкл полученной суспензии наносили на предметные стекла. Клетки осаждались на стекле в результате 30-минутной инкубации во влажной камере. Излишки раствора удаляли, клетки заключали в забуференный фосфатным буфером 1:1 глицерин, предметное стекло герметично закрывали покровным. Результаты анализировали путем флюоресцентной и фазово-контрастной микроскопии (микроскоп «Axiophot» фирмы «Opton», Германия). Кроме количественного определения числа позитивных клеток (%) оценивалась степень экспрессии антигенов по интенсивности флюоресценции. Интенсивность свечения нормальных В-лимфоцитов из крови донора принималась за умеренную (+). Соответственно этой точке отсчета отмечалось отсутствие свечения (-), слабое (±) или сильное свечение (++). Использовавшиеся моноклональные антитела приведены в таб.1.

Таблица 1. Панель использованных при иммунофенотипировании моноклональных антител.

 

Кластер дифферен- цировки	Cпецифичность
CD3	Т-клетки, входит в состав Т-антигенного рецептора
CD4	Т-хелперы/индукторы
CD5	Зрелые Т-клетки, часть В-лимфоцитов, лиганд CD72
CD8	Т-супрессии/киллеры
CD10	Пре-В, В-лимфоциты центра фолликула, гранулоциты, мембранная эндопептидаза
CD19	Предшественники и зрелые В-лимфоциты
CD20	Часть предшественников и зрелые В-лимфоциты
CD21	Предшественники и зрелые В-лимфоциты, CR2 рецептор комплемента и EBV
CD22	Предшественники (сначала в цитоплазме) и зрелые В-лимфоциты, медиатор адгезии к другим клеткам
CD23	Часть В-лимфоцитов, моноциты, эозинофилы, дендритные клетки
CD25	Активированные В- и Т-лимфоциты, α-рецептор ИЛ-2
CD35	Гранулоциты, моноциты, В-лимфоциты, эритроциты, CR1 рецептор комплемента
CD38	Плазмациты, тимоциты, активированные Т- и В-лимфоциты
CD43	Зрелые Т-лимфоциты, часть В-лимфоцитов
CD71	Рецептор трансферрина
-	FMC7 – конформационный эпитоп антигена CD20, иммунологически зрелые В-лимфоциты
-	Anti-kappa/lambda – моноклональные антитела к легким цепям Ig
-	Ki-67 – ядерный антиген делящихся клеток фазы G1-М
CD11c	«ворсинчатые» В-лимфоциты
CD103	Активированные CD8+Т-лимфоциты, «ворсинчатые» В-лимфоциты
Анти-ВКЛ (DBA.44)	В-лимфоциты, моноциты, «ворсинчатые» В-лимфоциты
CD85	Иммуноглобулин-подобный рецептор Т-лимфоцитов, NK-клеток

 

2. Тартрат-устойчивую кислую фосфатазу (TRAP) лимфоцитов определяли в лаборатории гемоцитологии (заведующий – профессор, д.м.н. Г.И.Козинец, в.н.с. лаборатории к.б.н. О.А.Дягилева, с.н.с. к.б.н. И.Н.Наумова) на фиксированных мазках лейкоконцентрата или костного мозга, инкубированных в смеси реактивов в течение 2 часов при 37^о.

3. Иммунохимическое исследование белков крови и мочи проводили в лаборатории гуморального иммунитета ГНЦ РАМН (зав. лабораторией к.м.н. Е.Ю.Варламова). Содержание в сыворотке IgA, IgG, IgM, легких цепей каппа и лямбда определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле агарозы. Для выявления секреции моноклонального иммуноглобулина исследовали образцы сыворотки и концентрированной мочи методом электрофореза в геле агарозы и иммунофиксации. Уровень ЦИК определяли методом осаждения в ПЭГ-6000.

По результатам проведенного обследования из 160 включенных больных были сформированы следующие группы:

I. По форме заболевания –

а) с типичной формой ВКЛ - 118 пациентов;

б) с вариантной формой ВКЛ (без лейкопении) - 42 пациента.

II. По возрасту –

больные ВКЛ молодого возраста (≤40 лет) - 41 пациент;

В каждой из выделенных групп больных оценивали клинические особенности течения заболевания, данные лабораторных исследований, эпидемиологические данные по полу и возрасту, по частоте выявления типичного и абберантного иммунофенотипа.

Проведен сравнительный анализ эффективности различных вариантов хирургического (спленэктомия) и консервативного (α-Иф, кладрибин) лечения во всех группах. Охарактеризован спектр и тяжесть осложнений проводимого лечения. Проанализированы редкие случаи заболевания: ВКЛ с секрецией парапротеина, с выраженной лимфаденопатией, с хроническим лимфолейкозом, с Т-клеточной клональностью. Приведены данные о встречаемости вторых опухолей у включенных в исследование больных ВКЛ. Проведен анализ рецидивов заболевания за 12-летний период и результаты их лечения.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: