Этапы приготовления постоянного гистологического препарата.

Прежде, чем начать работу с микроскопом, нужно уста­новить его на рабочем месте так, чтобы он был обращен колонкой к наблюдателю, а зеркалом к источнику света. Затем установить освещение при слабом увеличении объектива, повернув зеркало так, чтобы поле зрения микроскопа было освещено равномерно и достаточно ярко, но чтобы свет не раздражал глаз. После этого положить препарат на предметный столик по­кровным стеклом кверху, чтобы объектив приходился против отверстия столика. Микроскопирование препарата всегда надо начинать при слабом увеличении, глядя сбоку на микро­скоп, нужно опустить его тубус, вращая от себя макровинт до тех пор, пока фронтальная ли­ния объектива не будет на расстоянии 0, 5 см от покровного стекла. Затем, смотрят в окуляр левым глазом и, держа при этом правый глаз открытым, медленно вращать макровинт на себя до получения изображения препарата. Для более четкой наводки пользуются микровинтом, вращая его не более, чем на пол-оборота в обоих направлениях. С помощью микровинта мож­но определить толщину препарата в мкм. Изучая препарат при слабом увеличении микроско­па, нельзя ограничиваться одним полем зрения – необходимо исследовать препарат по всей его поверхности, т. к. заключенный под покровное стекло гистологический срез может лежать не совсем горизонтально, и толщина его частей может быть разной, при его перемещении те­ряется четкость изображения. Поэтому нужно, передвигая препарат держать свободную руку на макровинте и слегка вращать его. Но при этом нужно помнить, что микроскоп дает обрат­ное изображение, т. е. при перемещении препарата сверху вниз изображение будет двигаться снизу вверх. После того, как найдено на препарате хорошее место дальнейшего изучения, не­обходимо поставить его в центре поля зрения и закрепить препарат зажимами. После этого сменить увеличение на сильное: поднять тубус микроскопа при помощи поворота микровин­та на себя, сменить объектив слабого на объектив сильного увеличения поворотом револьве­ра. Глядя сбоку на микроскоп, вращают микровинт от себя до тех пор, пока фронтальная лин­за не приблизиться вплотную к покровному стеклу. После этого, глядя в окуляр, осторожно вращать микровинт на себя до появления четкого изображения препарата. Наиболее четкая наводка на фокус достигается вращением микровинта так же, как и при слабом увеличении. После окончания микроскопирования нельзя сразу снимать препарат с предметного стекла, нужно предварительно поднять тубус несколькими оборотами макровинта, иначе можно по­вредить препаратом фронтальную линзу. Затем приводят микроскоп в исходное состояние, т. е. ставят над отверстием столика объектив слабого увеличения на расстоянии 2-3 см. от не­го. Перенося микроскоп, держат правой рукой колонку штатива, а левую подставляют под его основание. С помощью оптических микроскопов можно изучать биологические объекты при различном увеличении. Увеличение до 440 х дают «сухие» объекты, т. е. те, при работе с которыми между препаратом и объективом имеется небольшое пространство (воздух), боль­шое увеличение достигается с помощью короткофокусных объективов, когда между объективом и исследуемым препаратом помещают каплю жидкости (вода, масло). Эта система называется иммерсионной. В зависимости от применяемой жидкости различают масляную или водную иммерсию. Иммерсионная система позволяет изучать препараты с увеличением в 1200-1500 раз. Оптические микроскопы обладают ограниченными данными, в связи с чем, в гистологию введены новые методы микроскопии.

 

Этапы приготовления постоянного гистологического препарата.

Постоянный гистологический препарат – это изготовленный из тканей и органов объект, позволяющий узнать их структуру с помощью микроскопирования. Он может представлять собой тонкий срез органов, тотальный препарат (мягкая мозговая оболочка, рыхлая соединительная ткань), мазок (крас­ный костный мозг, кровь и пунктат органа), отпечаток органов (печень, селезёнка). Обработка объектов для приготовления из него постоянного гистологического препарата включает следующие моменты: (1) взятие материала, (2) фиксирование, (3) обезвоживание и уплотнение, (4) заливка в плотные среды, (5) изготовление срезов, (6) окрашивание, (7) просветление и заключение в среду, служащую для сохра­нения препаратов.

Взятие материала: В клинике используют несколько способов взятия биопсийного материала: открытый, пункционный, аспирационный, эндоскопический, трепанобиопсия. Кроме того, важное значение имеет цитологический метод (мазки, отпечатки и т. д. ), связанный с минимальной травмой при взятии материала и возможностью проведения исследования в экстренном порядке. Гистологические и цитологические методы взаимно дополняют друг друга.

Объекты, подлежащие исследованию, заби­раются как можно раньше после забоя животного и сразу же фиксируются или за­мораживаются для сохранения структуры органов. В некоторых случаях пользуют­ся иссечением тканей из живого организма (биопсия) с целью диагностического морфологического исследования. Иссечение кусочков проводится острым инстру­ментом (бритвы, секционные ножи) во избежание повреждения тканей. Ножница­ми пользуются при иссечении оболочек (сальник, мягкая мозговая оболочка) и тонкостенных полых органов (желчный пузырь, кишечник). Кусочки из костей выпиливают, иссекают с учетом микроскопического строения того или иного ор­гана или тканей величиной 1-1, 5 см³; например почки и надпочечник вырезают с таким расчетом, чтобы в них попали корковое и мозговое вещество, для чего раз­резы ведут перпендикулярно поверхности органов. Из органов, имеющих во всех частях одинаковое строение (печень, селезёнка) объекты можно иссекать в любом участке, но желательно с капсулой. Кусочки из патологически изменённых тканей (опухоли, язвы) вырезают на границе с нормальными тканями так, чтобы были за­хвачены и нормальные, и изменённые участки.

Фиксация. Цель фиксации – закре­пление и сохранение тканевых структур в том виде, в котором они находились в момент забора материала. Это достигается коагуляцией белков фиксирующими жидкостями, которые должны достаточно быстро проникать в ткани и действовать " мягко", не вызывая грубых нарушений тканевых структур (например сморщива­ние, чрезмерное уплотнение). К фиксирующим жидкостям относят формалин, спирт, слабые растворы уксусной, азотной, хромовой и др. кислот, сулему, двухромовокислый калий. Фиксаторы, состоящие из какого-либо одного вещества называются простыми фиксаторами. Чаще применяются сложные фиксаторы, состоящие из смеси нескольких простых фиксирующих компонентов. Так, например, раствор Буэна включает уксусную, пикриновую кислоты и формалин, жидкость Ценкера состоит из двухромовокислого калия и сулемы, а жид­кость Мюллера - это смесь двухромовокислого калия, сульфата натрия в воде. Выбор фиксатора зависит от характера объекта и цели, которая ставится при изготовле­нии препарата. Например, чтобы сохранить в клетках включения жира, следует применять формалин, а не спирт, т. к. он является растворителем жира. В то же время этиловый спирт - наилучший фиксатор при исследовании в клетках железа, гликогена и нуклеиновых кислот. После фиксации кусочки промывают водой, если фиксатор содержит вещество, мешающее дальнейшей обработке (сулема, формалин). Если таких веществ нет (спирт или смеси, содержащие спирт), то кусочки не промываются.

Обезвоживание. Уплотнение. Обезвоживание исследуемого образца производят в спиртах возрастающей концентрации (50 °, 60 °, 70 °, 80 °, 90 °, 100°) с целью уп­лотнения ткани и подготовки ее к пропитыванию целлоидином или парафином. В каждом спирте исследуемый образец выдерживают не менее суток.

Заливка. Для того чтобы из кусочка можно было приготовить срез, необходимо придать ему еще более плотную консистенцию. Для этих целей применяются парафин и целлоидин. Принцип заливки заключается в последовательном проведении кусочка через ряд жидкостей, из которых каждая предыдущая должна обладать способностью сме­шиваться с последующей. Схема заливки в парафин состоит в следующем: 1. Спирт 100° – 1-2 часа; 2. Смесь 100° спирта и ксилола 1: 1 – до погружения кусочка; З. Ксиол (хлороформ) 1час; 4. Раствор парафина в ксилоле – 0, 5-1 час; 5. Расплавленный парафин (воск) 1-2 часа. Время каждого этапа заливки вместе с тем определяется особенностями объекта. После пребывания в расплавленном па­рафине в термостате при температуре 37°С –1-2 часа или при 56°С 0, 5-1 час, обра­зец полностью пропитывается парафином. В целях полного освобождения объекта от ксилола кусочки проводят последовательно через 2-5 порций расплавленного парафина. Затем кусочек вместе с расплавленным парафином помещают в формочку, где он застывает при комнатной температуре в плотный блок.

Схема заливки в целлоидин состоит в последовательной проводке материала в 100° спирте, смеси спирта и эфира, 5% целлоидине. В каждом растворе целлоидина образец выдерживают от 3 до 7 дней, после чего кусочек вследствие испарения спирта и эфира застывает в плотный гель. Это позволяет нарезать исследуемый образец с прилежащим целлоидином и наклеить его на деревянный брусок. Таким образом, парафиновые блоки могут сохраняться длительное время, а целлоидиновые помещают в 70° спирт для сохранения. Наряду с названными уп­лотняющими средствами, в настоящее время применяют синтетические смолы и полимеры (например, поливакс, карбовакс или полиэтиленгликоль).

Изготовление срезов. Из залитых целлоидиновых и парафиновых блоков готовят срезы необходимой толщины (5-10мкм) на специальных приборах различной конструкции - микротомах. Наиболее распространённым является санный микротом (МС-2), в котором нож и объектодержатель движутся на специальных салазках.

Основные части микротома: 1. Станина – массивная чугунная основа, на которую монтируются все остальные узлы. 2. Механизм подъема. 3. Зажим для блока. 4. Ножевые салазки, несущие на себе ножедержатель. Последний укрепляется на салазках рукояткой, позволяющей менять горизонтальный угол расположения ножа. Зажим снабжен подвижной цилиндрической втулкой, перемещение которой с помощью винта меняет угол наклона ножа. 5. Механизм микропередачи состоит из стержня соединённого с тягой храповика микровинта. Эта система поднимает столик с объективом на высоту, соответствующую толщине среза, а движущийся в горизонтальной плоскости нож режет блок.

При необходимости получения препарата в короткий срок (например, с диагностической целью) используется замораживающий микротом или криостат. Первый построен по санному принципу, но имеет особенности конструкции и монтажа. Основные его узлы: станина, меха­низм подъёма, бритводержатель и замораживающий столик. Криостат, в свою оче­редь, представляет собой холодильник, в рабочей камере которого установлен микротом. Сравнительно небольшой объём камеры, надежная теплоизоляция, наличие специального регулирующего механизма, позволяют поддерживать постоянно заданную минусовую температуру. Таким образом, уплотнение материала при резке на замораживающем микротоме и криостате достигается замораживанием образца.

Окрашивание. С тех пор, как было установлено, что отдельные составные части клеток, и межклеточные элементы по-разному воспринимают и удерживают красители, было предложено большое количество окрасок препаратов. Хотя до настоящего времени полностью не выяснена сущность механизмов действия многих красителей, несомненно, что в основе окрашивания микроструктур лежат физико-химические процессы. Из физических факторов следует отметить диффузию, адсорбцию (поверхностное впитывание) красителя, а также его растворимость, из химических - электролитические свойства красящих веществ в самих тканях. Немаловажное значение имеет плотность тканей и дисперсность самого красителя. Первое свойство определяет последовательность окраски отдельных структур, второе - скорость процесса окраски. На электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислые и нейтральные. Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структура кислой природы (например: хроматин, ядра, содержащие ДНК, ядрышко, содержащие РНК). Отсюда и термин – базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся красителями, таким как тионин, гематоксилин, метиловый зелёный, кармин, азур, сафранин и др. Кислотный краситель – это красящая кислота и её соль, в силу чего она окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эозинофильных лейкоцитов, цитоплазму большинства клеток. Отсюда оксифилен для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями, к которым относятся эозин, кислый фуксин, конго красный, анилиновый синий и др. Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кислотного и основного красителя, например судан - 3, эозиновокислый ме-тиленовый синий. Кроме того, в гистологической практике часто используются специальные красители. Так, например, для выявления жира применяется судан-3 и шарлах красный. Первый окрашивает жир в желтый, а второй – в оранжевый цвет. Осмиевая кислота окрашивает жиры в черный цвет. Эластические волокна при обработке орсеином окрашиваются в коричневый цвет, резорцин фуксином в темносиний цвет, а пикрофуксин окрашивает их в желтый цвет. Для выявления нервных элементов, клеточных границ и органоидов в различных тканях применяется импрегнация (пропитывание) раствором азотистокислого серебра, осмиевой кислоты, хлорного золота, основанная на восстановлении свободных металлов и осаждении их на исследуемых структурах.

Просветление и заключение. Сохранение прозрачности, окраска и структур­ная целостность постоянного гистологического препарата обеспечивается просветлением и заключением препарата в специальные среды. Средой для заключения служат смола канадской основы (канадский бальзам) и пихтовая смола, употребляющиеся в виде густых растворов этих смол в ксилоле. Применение их при предварительном обезвоживании абсолютным спиртом и просветлении ксилолом. При отсутствии смол можно пользоваться дамарным лаком (60% раствор смолы деревьев рода произрастающих в Индии) или раствором канифоли в спирте, который получают из различных видов сосны. В тех случаях, когда по условиям обработки препарат не может соприкасаться со спиртом, ксилолом и т. п. (например окраски на жиры) его заключают в среду (глицерин, глицерин-желатин), которые, кроме того, обладают просветляющими свойствами. Например, широко распро­страненными методами окраски препаратов является окраска гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.

Органеллы и их классификация. Органеллы – постоянно присутствующие в цитоплазме клетки структуры, специализированные на выполнении определенных функций. Они подразделяются на органеллы общего значения (1) и специальные органеллы (2):

1. Общие органеллы имеются во всех клетках и необходимы для обеспечения их жизнедеятельности – митохондрии, рибосомы, эндоплпзматическая сеть, комплекс Гольджи, лизосомы, пероксисомы, клеточный центр, структуры цитоскелета.

Митохондрия — это спиральная, округлая, вытянутая или разветвленная органелла. Впервые понятие митохондрия было предложено Бенда в 1897 г.

Митохондрии можно обнаружить в живых клетках с помощью фазово-контрастной и интерференционной микроскопии в виде зерен, гранул или нитей. Это довольно подвижные структуры, которые могут перемещаться, сливаться друг с другом, делиться. При окраске специальными методами в погибших клетках при световой микроскопии митохондрии имеют вид мелких зерен (гранул), диффузно распределенных в цитоплазме или концентрирующихся в каких-то определенных ее зонах. В результате разрушения глюкозы и жиров в присутствии кислорода в митохондриях образуется энергия, а органические вещества превращаются в воду и диоксид углерода. Именно таким образом получают основную энергию, необходимую для жизнедеятельности, животные организмы. Энергия накапливается в аденозинтрифосфате (АТФ), а точнее, в его макроэргических связях. Функция митохондрий тесно связана с окислением органических соединений и использованием освобождающейся при их распаде энергии для синтеза молекул АТФ. Поэтому митохондрии часто называют энергетическими станциями клетки, или органеллами клеточного дыхания. АТФ выполняет функцию поставщика энергии, перенося одну из своих богатых энергией концевых фосфатных групп на другую молекулу, и превращается при этом в АДФ. Предполагают, что в эволюции митохондрии были прокариотическими микроорганизмами, которые стали симбиотами в организме древней клетки. В последующем они стали жизненно необходимы, что было связано с увеличением содержания кислорода в атмосфере Земли. С одной стороны, митохондрии удаляли избыток токсичного для клетки кислорода, а с другой — обеспечивали энергией. Без митохондрий клетка практически не в состоянии использовать кислород как вещество, обеспечивающее поставку энергии, и может восполнять свои энергетические потребности лишь путем анаэробных процессов. Таким образом, кислород — это яд, но яд жизненно важный для клетки, причем избыток кислорода так же вреден, как и его недостаток. Митохондрии могут изменять свою форму и перемещаться в те области клетки, где потребность в них наиболее высока. Так, в кардиомиоцитах митохондрии находятся вблизи миофибрилл, в клетках почечных канальцев вблизи базальных впячиваний и т. д. В клетке содержится до тысячи митохондрий, и их количество зависит от активности клетки. Митохондрии имеют средние поперечные размеры 0, 5…3 мкм. В зависимости от размеров выделяют мелкие, средние, крупные и гигантские митохондрии (формируют разветвленную сеть — митохондриальный ретикулум). Размеры и число митохондрий тесно связаны с активностью клетки и ее энергопотреблением. Они крайне изменчивы и в зависимости от активности клетки, содержания кислорода, гормональных влияний могут набухать, изменять число и структуру крист, варьировать в числе, форме и размерах, а также ферментативной активности. Объемная плотность митохондрий, степень развития их внутренней поверхности и другие показатели зависят от энергетических потребностей клетки. В лимфоцитах имеется всего по несколько митохондрий, а в печеночных клетках их 2…3 тыс. Митохондрии состоят из матрикса, внутренней мембраны, перимитохондриального пространства и наружной мембраны. Наружная митохондриальная мембрана отделяет органеллу от гиалоплазмы. Обычно она имеет ровные контуры и замкнута так, что представляет собой мембранный мешок. Внешнюю мембрану от внутренней отделяет перимитохондриальное пространство шириной около 10…20 нм. Внутренняя митохондриальная мембрана ограничивает собственно внутреннее содержимое митохондрии — матрикс. Внутренняя мембрана образует многочисленные выпячивания внутрь митохондрий, которые имеют вид плоских гребней, или крист. По форме кристы могут иметь вид пластинок (трабекулярные) и трубочек (мультивезикулярные на срезе), а направлены они продольно или поперечно по отношению к митохондрии. Каждая митохондрия заполнена матриксом, который на электронных микрофотографиях выглядит плотнее, чем окружающая цитоплазма. Матрикс митохондрии однородный (гомогенный), иногда мелкозернистый, различной электронной плотности. В нем выявляют тонкие нити толщиной около 2…3 нм и гранулы размером около 15…20 нм. Нити матрикса представляют собой молекулы ДНК, а мелкие гранулы — митохондриальные рибосомы. В матриксе содержатся ферменты, одна одноцепочечная, циклическая ДНК, митохондриальные рибосомы, много ионов Са2+. Автономная система белкового синтеза митохондрий представлена молекулами ДНК, свободными от гистонов. ДНК короткая, имеет форму кольца (циклическая) и содержит 37 генов. В отличие от ядерной ДНК в ней практически нет некодирующих последовательностей нуклеотидов. Особенности строения и организации сближают ДНК митохондрий с ДНК бактериальных клеток. На ДНК митохондрий происходит синтез молекул РНК разных типов: информационных, трансфертных (транспортных) и рибосомальных. Информационная РНК митохондрий не подвергается сплайсингу (вырезанию участков, не несущих информационной нагрузки). Малые размеры молекул митохондриальных ДНК не могут определить синтез всех белков митохондрий. Большинство белков митохондрий находится под генетическим контролем клеточного ядра и синтезируется в цитоплазме, так как ДНК митохондрий слабо выражена и может обеспечить образование лишь части ферментов цепи окислительного фосфорилирования. Митохондриальная ДНК кодирует не более десяти белков, которые локализованы в мембранах и представляют собой структурные белки, ответственные за правильную интеграцию отдельных функциональных белковых комплексов митохондриальных мембран. Синтезируются также белки, осуществляющие транспортные функции. Такая система белкового синтеза не обеспечивает всех функций митохондрии, поэтому автономия митохондрий ограниченная и относительная. У млекопитающих митохондрии при оплодотворении передаются лишь через яйцеклетку, а спермий привносит в новый организм ДНК ядра. В матриксе митохондрий образуются рибосомы, отличающиеся от рибосом цитоплазмы. Они участвуют в синтезе ряда митохондриальных белков, не кодируемых ядром. Митохондриальные рибосомы имеют число седиментации 60 (в отличие от цитоплазматических с числом седиментации 80). Число седиментации — это скорость осаждения при центрифугировании и ультрацентрифугировании. По строению митохондриальные рибосомы близки к рибосомам прокариотических организмов, но меньшего размера и отличаются чувствительностью к определенным антибиотикам (левомицетину, тетрациклину и др. ). Внутренняя мембрана митохондрии обладает высокой степенью избирательности при транспорте веществ. К ее внутренней поверхности прикрепляются тесно прилежащие друг к другу ферменты цепи окислительного фосфорилирования, белки-переносчики электронов, транспортные системы АТФ, АДФ, пируват и др. В результате тесного расположения ферментов на внутренней мембране обеспечивается высокая сопряженность (взаимосвязанность) биохимических процессов, повышающая скорость и эффективность каталитических процессов. При электронной микроскопии выявляют грибовидные частицы, выступающие в просвет матрикса. Они обладают АТФ-синтетичной (образует АТФ из АДФ) активностью. Транспорт электронов идет по дыхательной цепи, локализованной во внутренней мембране, которая содержит четыре крупных ферментных комплекса (цитохромы). При прохождении электронов по дыхательной цепи ионы водорода откачиваются из матрикса в перимитохондриальное пространство, что обеспечивает формирование протонного градиента (помпы). Энергия этого градиента (различия в концентрации веществ и формирование мембранного потенциала) используется для синтеза АТФ и транспорта метаболитов и неорганических ионов. Содержащиеся на внутренней мембране белки-переносчики транспортируют через нее органические фосфаты, АТФ, АДФ, аминокислоты, жирные кислоты, три — и дикарбоновые кислоты. Наружная мембрана митохондрии более проницаема для низкомолекулярных веществ, так как в ней много гидрофильных белковых каналов. На наружной мембране располагаются специфические рецепторные комплексы, через которые белки из матрикса транспортируются в перимитохондриальное пространство. По своему химическому составу и свойствам наружная мембрана близка к другим внутриклеточным мембранам и плазмолемме. В ней содержатся ферменты, метаболизирующие жиры, активирующие (катализирующие) превращения аминов, аминооксидаза. Если ферменты наружной мембраны сохраняют активность, то это показатель функциональной сохранности митохондрий. В митохондриях имеются два автономных субкомпартмента. Вели перимитохондриальное пространство, или наружная камера митохондрии (внешний субкомпартмент), формируется за счет проникновения белковых комплексов гиалоплазмы, то внутренний субкомпартмент (матрикс митохондрии) частично образован за счет синтетической активности митохондриальной ДНК. Во внутреннем субкомпартменте (матриксе) содержатся ДНК, РНК и рибосомы. Он отличается высоким уровнем ионов Са2+ в сравнении с гиалоплазмой. Во внешнем субкомпартменте накапливаются ионы водорода. Ферментативная активность внешнего и внутреннего субкомпартментов, состав белков сильно различаются. Внутренний субкомпартмент имеет более высокую электронную плотность, чем внешний. Специфические маркеры митохондрий — ферменты цитохром-оксидаза и сукцинатдегидрогеназа, выявление которых позволяет количественно охарактеризовать энергетические процессы в митохондриях. Основная функция митохондрий — синтез АТФ. Вначале в гиалоплазме разрушаются сахара (глюкоза) до молочной и пировиноградной кислот (пирувата) с одновременным синтезом небольшого количества АТФ. В результате гликолиза одной молекулы глюкозы используется две молекулы АТФ, а образуется четыре. Таким образом, положительный баланс составляют всего две молекулы АТФ. Эти процессы совершаются без кислорода (анаэробный гликолиз). Все последующие этапы выработки энергии происходят в процессе аэробного окисления, который обеспечивает синтез большого количества АТФ. При этом органические вещества разрушаются до СO2 и воды. Окисление сопровождается переносом протонов на их акцепторы. Эти реакции осуществляются с помощью ряда ферментов цикла трикарбоновых кислот, которые находятся в матриксе митохондрии. В мембраны крист встроены системы переноса электронов и сопряженного с ним фосфорилирования АДФ (окислительное фосфорилирование). При этом происходит перенос электронов от одного белка-акцептора электронов к другому и, наконец, связывание их с кислородом, вследствие чего образуется вода. Одновременно с этим часть энергии, выделяемой при таком окислении в цепи переноса электронов, запасается в виде макроэргической связи при фосфорилировании АДФ, что приводит к образованию большого числа молекул АТФ — основного внутриклеточного энергетического эквивалента. На мембранах крист митохондрий происходит процесс окислительного фосфорилирования с помощью расположенных здесь белков цепи окисления и фермента фосфорилирования АДФ АТФ-синтетазы. В результате окислительного фосфорилирования из одной молекулы глюкозы образуется 36 молекул АТФ. К некоторым гормонам и веществам на митохондриях имеются специализированные (аффинные) рецепторы. Трийодтиронин в норме ускоряет синтетическую активность митохондрий. Интерлейкин-1 и высокие концентрации трийодтиронина разобщают цепи окислительного фосфорилирования, вызывают набухание митохондрий, что сопровождается увеличением образования тепловой энергии. Новые митохондрии образуются путем деления, перетяжкой или почкованием. В последнем случае образуется протомитохондрия, постепенно увеличивающаяся в размерах. Протомитохондрия — мелкая органелла с наружной и внутренней мембранами. Внутренняя мембрана не имеет или содержит слаборазвитые кристы. Органелла характеризуется низким уровнем аэробного фосфорилирования. При образовании перетяжки содержимое митохондрии распределяется между двумя новыми довольно крупными органеллами. При любом способе размножения в каждой из вновь образующихся митохондрий имеется собственный геном. Старые митохондрии разрушаются путем аутолиза (самопереваривания клеткой с помощью лизосом) с образованием аутолизосом. Из аутолизосомы образуется остаточное тельце. При полном переваривании содержимое остаточного тельца, состоящее из низкомолекулярных органических веществ, выводится путем экзоцитоза. При неполном переваривании остатки митохондрий могут накапливаться в клетке в виде слоистых телец или гранул с нипофусцином. В части митохондрий накапливаются нерастворимые соли кальция с образованием кристаллов — кальцинатов. Накопление продуктов дегенерации митохондрий может привести к дистрофии клетки

 

Рибосомы. Рибосома представляет собой элементарную клеточную машину синтеза любых белков клетки. Все они построены в клетке одинаково, имеют одинаковую молекулярную композицию, выполняют одинаковую функцию – синтез белка – поэтому их можно так же считать клеточными органоидами. В отличие от других органоидов цитоплазмы (пластид, митохондрий, клеточного центра, мембранной вакуолярной системы и др. ) они представлены в клетке огромным числом: за клеточный цикл их образуется 1 х 107 штук. Поэтому основная масса клеточной РНК представляет собой именно рибосомную РНК. РНК рибосом относительно стабильна, рибосомы могут существовать в клетках культуры ткани в течение нескольких клеточных циклов. В печеночных клетках время полужизни рибосом составляет 50-120 часов.

 

Рибосомы – это сложные рибонуклеопротеидные частицы, в состав которых входит множество молекул индивидуальных (неповторенных) белков и несколько молекул РНК, Рибосомы прокариот и эукариот по своим размерам и молекулярным характеристикам отличаются, хотя и обладают общими принципами организации и функционирования. К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения полностью расшифрована структура рибосом.

 

Полная, работающая рибосома, состоит из двух неравных субъединиц, которые легко обратимо диссоциируют на большую субъединицу и малую. Размер полной прокариотической рибосомы составляет 20 х 17 х 17 нм, эукариотической – 25 х 20 х 20. Полная прокариотическая рибосома имеет коэффициент седиментации 70S и диссоциирует на две субъединицы: 50S и 30S. Полная эукариотическая рибосома, 80S рибосома, диссоциирует на 60S и

 

40S субъединицы. Форма и детальные очертания рибосом из разнообразных организмов и клеток, включая как прокариотические, так и эукариотические, поразительно похожи, хотя и отличаются рядом деталей. Малая рибосомная субъединица имеет палочковидную форму с несколькими небольшими выступами (см. рис. 81), ее длина составляет около 23 нм, а ширина – 12 нм. Большая субъединица похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При ассоциации в полную 70S рибосому малая субчастица ложится одним концом на один из выступов 50S частицы, а другим в ее желобок. В состав малых субъединиц входит по одной молекуле РНК, а в состав большой – несколько: у прокариот – две, а у эукариот – 3 молекулы. в состав эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины: 28S РНК содержит 5000 нуклеотидов, 18SРНК – 2000, 5, 8S РНК – 160, 5SРНК – 120. Рибосомные РНК обладают сложной вторичной и третичной структурой, образуя сложные петли и шпильки на комплементарных участках, что приводит к самоупаковке, самоорганизации этих молекул в сложное по форме тело. Так, например, сама по себе молекула 18S РНК в физиологических ионных условиях образует палочковидную частицу, определяющую форму малой субъединицы рибосом.

 

Под действием низких ионных сил, особенно при удалении ионов магния, плотные рибосомные субъединицы могут разворачиваться в рыхлые рибонуклеопротеидные тяжи, где можно наблюдать кластеры отдельных белков, но правильных структур, типа нуклеосом, нет, т. к. нет групп из сходных белков: в рибосоме все 80 белков разные.

 

Для того, чтобы образовались рибосомы необходимо наличие четырех типов рибосомных РНК в эквимолярных отношениях и наличие всех рибосомных белков. Сборка рибосом может происходить спонтанно in vitro, если последовательно добавлять к РНК белки в определенной последовательности.

 

Следовательно для биосинтеза рибосом необходим синтез множества специальных рибосомных белков и 4-х типов рибосомной РНК. Где эта РНК синтезируется, на каком количестве генов, где эти гены локализованы, как они организованы в составе ДНК хромосом – все эти вопросы в последние десятилетия были успешно разрешены при изучении строения и функции ядрышек.

Впервые комплекс Гольджи был обнаружен в нервной клетке в 1898 г. итальянским ученым Гольджи. В последующие годы он был открыт в других клетках разных тканей позвоночных и беспозвоночных животных. В растительных клетках, где существование его долгое время оспаривалось, аппарат Гольджи был найден значительно позже, с помощью электронной микроскопии.

 

На уровне светового микроскопа аппарат Гольджи выявляется методом импрегнации серебром или солями осмия. Его иногда называют сетчатым аппаратом, так как во многих клетках или в различные моменты функционирования одной и той же клетки эта структура имеет вид сети. Другие названия данного органоида – комплекс Гольджи, «пластинчатый комплекс» и «внутриклеточный сетчатый аппарат».

 

В световом микроскопе различают две основные формы аппарата Гольджи: сетчатую и диктиосомную, говорят также о компактной и диффузной формах данного органоида. Различная форма аппарата Гольджи бывает связана либо с функциональным состоянием клетки, либо со степенью ее дифференцировки, либо с видовой специфичностью. Сетчатая форма комплекса Гольджи локализуется обычно поблизости от ядра, тогда как диктиосомы могут распределяться по цитоплазме клеток по-разному. Диктиосомы представляют собой отдельные фрагменты сети – это тельца или чешуйки разнообразной формы.

 

В растительных клетках, в клетках беспозвоночных животных и в большинстве клеток эмбриональных тканей чаще всего наблюдается диктиосомная форма органоида.

 

В большинстве тканей взрослого организма животных обычно встречается сетевидная форма аппарата. В неполярных клетках органоид располагается вокруг ядра, в полярных клетках он находится у активной поверхности клетки. Примером клетки, для которой характерны вариации в строении, а также степени развития и локализации комплекса Гольджи в связи с функциональным состоянием, является железистая клетка. Так, в клетках экзокринной части поджелудочной железы до начала выработки секрета аппарат Гольджи бывает сильно развит и локализуется в зоне, прилежащей к ядру. По мере накопления секреторных включений происходит постепенное перемещение элементов аппарата в апикальную часть клетки. После выделения секрета степень развития органоида резко падает.

 

В последнее время многие исследователи относят аппарат Гольджи к элементам эндоплазматической сети. Это связано с тем, что на уровне электронного микроскопа он представляет собой в основном систему внутриклеточных мембранных структур; вакуолей и цистерн.

 

Комплекс Гольджи на световом уровне.

 

 

Анализ ультраструктуры комплекса Гольджи в различных клетках животных и растений показал, что структура его элементов у разных объектов однотипна. В наиболее полном виде она слагается из плоских цистерн, вакуолей различных размеров и мелких пузырьков. Это система бывает связана с эндоплазматической сетью. Все элементы аппарата Гольджи не всегда бывают полностью представлены. Иногда преобладает тот или иной компонент. Чаще всего цистерны комплекса Гольджи расположены группами по 5 – 8 – 12, но число, размеры, а также расстояние между ними может варьировать в клетках различных тканей, Число и размер вакуолей тоже очень разнообразны.

 

В состав мембран комплекса Гольджи входят фосфолипиды и белки. Здесь можно обнаружить и незначительное количество ферментов, в частности связанных с синтезом липидов и полисахаридов и, кроме того, некоторые фосфатазы (например, кислая фосфатаза, тиаминпирофосфатаза, нуклеозиддифосфатаза).

 

Функционально аппарат Гольджи связан с целым рядом важных процессов, происходящих в клетке. Он участвует в секреторной функции клетки. С помощью метода электронной авторадиографии было показано, где идет синтез секреторных продуктов и какова их судьба в клетке. В начале процесса выработки секрета секреторный

12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: