Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, - дот-блот анализ - либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза - Вестерн-блот анализ (Western blotting).

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны.

Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Западным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо переноситься на мембрану, если в транс-буфере присутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задержке крупных белков. Мембрана ПВДФ оптимизирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшиеся белки до 160 мкг/см² при очень низком уровне неспецифического связывания. Немаловажное свойство этой мембраны - возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам.

После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.

Вестерн-блот: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются в порядке молекулярной массы (рис. 1). На мембраны могут быть также нанесены 1-2 дополнительные линии с клинически значимыми антигенами (вестерн-лайн блот). Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.

 

53. Хроматография. Виды хроматографии. Принцип метода. Значение для исследований в биологии и значение в диагностике заболеваний.

ХРОМАТОГРАФИЯ - это метод разделения, анализа и физ.-хим. исследования в-в. Обычно основана на распределении исследуемого в-ва между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент).
Неподвижная фаза гл. обр. представляет собой сорбент с развитой пов-стью, а подвижная - поток газа (пара, флюида -в-во в сверхкритич. состоянии) или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента.

Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

Основные виды хроматографии
В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую, флюидную (или сверхкритич. хроматографию с флюидом в качестве элюента; см. Капиллярная хроматография)и жидкостную хроматографию. В качестве неподвижной фазы используют твердые (или твердообразные) тела и жидкости. В соответствии с агрегатным состоянием подвижной и неподвижной фаз различают следующие виды хроматографии:
1) газо-твердофазную хроматографию, или газоадсорбционную хроматографию; 2) газо-жидкостную хроматографию (газо-жидко-твердофазную);
3) жидко-твердофазную хроматографию;
4) жидко-жидкофазную хроматографию;
5) флюидно-твердофазную хроматографию;
6) флюидно-жидко-твердофазную хроматографию.

Строго говоря, газо-жидкостная хроматография пока не реализована, на практике используют только газо-жидко-твердо-фазную хроматографию (см. Газовая хроматография). Жидко-жидкофазная хроматография реализована, однако преим. используют жидко-жидко-твердо-фазную хроматографию (неподвижной фазой служит твердый носитель с нанесенной на его пов-сть жидкостью; см. Жидкостная хроматография).

 

 

По механизму разделения в-в различают:

 

1. адсорбционную,
2. распределительную,
3. ионообменную,
4. эксклюзионную,
5. аффинную (биоспецифическую),
6. осадочную хроматографию.

На практике часто реализуется одновременно неск. механизмов разделения (напр., адсорбционно-распределителъный, адсорбционно-эксклюзионный и т. д.).
По геометрии сорбционного слоя неподвижной фазы различают колоночную и плоскослойную хроматографию. К плоскослойной относятся тонкослойная хроматография и бумажная хроматография. В колоночной хроматографии обычно выделяют капиллярную хроматографию, в к-рой сорбент расположен на внутр. стенках колонки, а центр, часть колонки остается незаполненной сорбентом, т.е. открытой для потока элюента (хроматография на открытых капиллярных колонках).

 

 

В зависимости от способа ввода пробы и способа перемещения хроматографич. зон по слою сорбента различают след. варианты хроматографии:

 

1. проявительный (или элюентный),
2. фронтальный
3. вытеснительный.

В наиб. часто используемом проявительном варианте анализируемую смесь периодически импульсно вводят в поток подвижной фазы; в колонке анализируемая смесь разделяется на отдельные компоненты, между к-рыми находятся зоны подвижной фазы.
Во фронтальном варианте хроматографии пробу, содержащую разделяемые в-ва, непрерывно подают в колонку. Можно также подавать в колонку одновременно пробу и подвижную фазу. Во фронтальной хроматографии только первый, наименее сорбируемый компонент можно получить в чистом виде на выходе из колонки, вторая и последующая зоны содержат по два и более компонентов разделяемой смеси.
В вытеснительном варианте хроматографии в колонку после подачи разделяемой смеси вводят спец. в-во (т. наз. вытеснитель), к-рое сорбируется лучше любого из разделяемых компонентов. В вытеснительной хроматографии образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых в-в. Во фронтальном и вытеснительном вариантах хроматографии необходима регенерация колонки перед след. опытом.

 

54. Спектроскопия и спектрометрия. Принцип метода. Значение для исследований в биологии и значение в диагностике заболеваний.

Спектроскопия – раздел науки и техники, изучающий взаимодействие между веществом и излучением (электромагнитным излучением или потоком частиц) и применяющий полученные результаты для решения различных прикладных задач (определение химического состава, измерение температуры, давления, деформации и т.д.)
Спектрометрия – методология измерения этих взаимодействий, позволяющая создавать и использовать такие приборы, как спектрометр или спектрограф. Диаграмма зависимости некоторой величины (чаще, интенсивности) от длины волны или другого параметра, характеризующего излучение, называется спектрограммой или, проще, спектром. В этом контексте, спектрометрия – это раздел спектроскопии, разрабатывающий теорию и методы измерения спектров.
На рисунке приведен спектр излучения флуоресцентной лампы, на котором отмечены пики, соответствующие различным компонентам газовой смеси лампы.

Иногда термин «спектрометрия» понимают в более узком – историческом – смысле, как измерение длины световых волн при помощи особых оптических приборов (спектрографов, спектроскопов, спектрометров) с целью изучения строения вещества. Однако в последнее время значение этого термина существенно расширилось в связи с развитием новых методов, в которых используется не только видимый свет, но и другие формы излучения.

ПРИНЦИП МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

 

Данный метод основан на поглощении световых волн молекулами вещества. Свет - это электромагнитные волны с длиной волны 4*10^-7 - 8*10^-7 м., которые излучаются при ускоренном движении заряженных частиц. Для того чтобы атом начал излучать энергию, ему необходимо передать энергию. Излучая, атом теряет полученную энергию, и для непрерывного свечения вещества необходим приток энергии к его атомам извне.

Все вещества, атомы которых находятся в возбужденном состоянии, излучают световые волны, энергия которых определенным образом распределена по длинам волн. Поглощение света веществом также зависит от длины волны. Так, красное стекло пропускает волны, соответствующие красному свету, и поглощает все остальные.

Если пропускать белый свет сквозь холодный, неизлучающий газ, то на фоне непрерывного спектра источника появляются темные линии. Газ поглощает наиболее интенсивно свет как раз тех длин волн, которые он испускает в сильно нагретом состоянии. Темные линии на фоне непрерывного спектра - это линии поглощения, образующие в совокупности спектр поглощения.

Существуют непрерывные, линейчатые и полосатые спектры излучения и столько же видов спектров поглощения. Линейчатые спектры играют особо важную роль, потому что их структура прямо связана со строением атома. Ведь эти спектры создаются атомами, не испытывающими внешних воздействий. Поэтому, знакомясь с линейчатыми спектрами, мы тем самым делаем первый шаг к изучению строения атомов. Наблюдая эти спектры, ученые получили возможность «заглянуть» внутрь атома. Здесь оптика вплотную соприкасается с атомной физикой.

Главное свойство линейчатых спектров состоит в том, что длины волн (или частоты) линейчатого спектра какого-либо вещества зависят только от свойств атомов этого вещества, но совершенно не зависят от способа возбуждения свечения атомов. Атомы любого химического элемента дают спектр, не похожий на спектры всех других элементов: они способны излучать строго определенный набор длин волн.

На этом основан спектральный анализ - метод определения химического состава вещества по его спектру.

 

55. Масс-спектрометрия. Принцип метода. Значение для исследований в биологии и значение в диагностике заболеваний.

Масс-спектрометрия является наиболее современным методом определения молекулярной массы, дающим очень точные результаты. Прибор с простой фокусировкой обеспечивает точность 0,2%, а с двойной — менее 0,01 %.

Масс-спектрометрия – это физический метод, основанный на измерении массы заряженных частиц материи, который используется для анализа вещества. Современные масс спектрометры способны фрагментировать детектируемые ионы и определять массу полученных фрагментов, вернее соотношение массы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле.

Таким образом, масс-спектр – это просто рассортировка заряженных частиц по отношениям массы к заряду. Так как большинство небольших органических молекул при ионизации приобретает только один заряд, то для упрощения говорят о разделении веществ по массе. Важным исключением из этого правила являются белки, нуклеиновые кислоты и другие полимеры, которые способны приобретать множественные заряды.

Масс-спектроскопия позволяет получать данные о структуре вещества.

Принцип метода заключается в следующем. Образец испаряют и вводят в ионизационную камеру прибора (если определяется молекулярная масса, то вещество в этих условиях должно оставаться стабильным). В ионизационной камере молекулы вещества под действием электронов различной энергии (50—70 эВ) превращаются в положительные молекулярные ионы: Молекулярные ионы образуются вблизи от положительно заряженного ускоряющего электрода, имеющего потенциал около 2 кВ. Положительные ионы под действием электростатических сил отталкиваются от электрода и с помощью вспомогательных электродов формируются в ионный пучок, который фокусируется на выходную щель ионизационной камеры. Затем ионный пучок проходит через магнитное поле, создаваемое электромагнитом. В результате этого направление пучка обычно изменяется на 90° и молекулярные ионы начинают двигаться по разным траекториям, определяемым отношением массы т к заряду е

 

Во всем мире метод ЭКО (экстракорпорального оплодотворения) рассматривается как основной способ лечения бесплодия. Он эффективен при любых его формах. Кроме того, ЭКО — зачастую единственный выход для семей, в которых болен мужчина.

Экстракорпоральное оплодотворение — сравнительно молодой метод лечения бесплодия. Впервые он был применён в Англии в 1978 году. Однако еще 200 лет назад предпринимались подобные попытки.

Суть ЭКО (экстракорпорального оплодотворения): сперматозоиды встречаются с яйцеклетками в пробирке, а затем их подсаживают в матку бесплодной женщины или суррогатной матери. При благоприятном исходе процедуры (наступлениибеременности), часты случаи, когда оплодотворение из пробирки приводит к многоплодной беременности: зачинается двойня или тройня, т.к. в попытке экстракорпорального оплодотворения принимают участие несколько яйцеклеток. По желанию женщины может производиться редукция (изъятие лишних зародышей), но бывает, что это приводит к гибели оставшихся и к последующему выкидышу.

Успех процедуры ЭКО составляет примерно 30-35%.

⇐ Предыдущая11121314151617181920Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: