Основные правила статистической обработки результатов морфометрического исследования.

 

Морфометрические методы описывают метрические свойства морфологических структур в двух- и трехмерной системе, позволяют провести трехмерную реконструкцию объекта. Различают планиметрию (на плоскости) и стереометрию (в объеме).

Статистические методы позволяют установить характер связи между различными признаками, сравнивать объекты одного и разных организмов и т.д.

Статистика необходима для строгого доказательства эффективности методов диагностики и лечения (какому проценту больных помогает лечение и в какой степени); для поиска новых методов диагностики и лечения, выбора наилучшего метода из существующих.

Для морфометрии используется программа Axio Vision (Zeiss). После получение результатов при помощи данной программы нужно сделать:

1. статистическое описание параметров распределения изучаемого признака

2. проверку статистических гипотез о различии групп по изучаемому признаку

3. статистическое моделирование

Описательная статистика:

1. Меры центральной тенденции:

– Среднее арифметическое

– Медиана (значение посередине интервала)

– Мода (наиболее часто встречающееся значение признака)

2. Меры рассеяния

– Размах (разность макс-мин)

– Интервал (значения от x до y % выборки, обычно 50% средних значений)

– Стандартное отклонение – размах значений относительно среднего арифметического, вычисляется по формуле.

Сравнение групп по изучаемому параметру проводят путем проверки статистических гипотез: цель - проверить обусловлены ли различия какой-то причиной или различия случайны.

Характер распределения: нормальное (гауссово), ненормальное (Логонормальное, Постоянное, Экспоненциальное, Хи-квадрат)

Методы оценки достоверности:

1. непараметрические применяются для признаков независимо от характера их распределения (критерий Вилкоксона, критерий Манна-Уитни, критерий Колмогорова-Смирнова)

2. параметрические применяются для признаков, имеющих нормальное распределение (критерий t-Стьюдента)

Формулы для вычисления критерия t-Стюдента:

 

 

35. Гибридологический метод исследования в биологии: принцип метода, значение и области использования.

Гибридологический метод генетики (изучение наследственности и изменчивости соматических клеток). Основа – их размножение в искусственно созданных условиях. Здесь анализируются генетические процессы отдельных клеток, а с учетом полноценности генматериала их можно использовать впоследствии для исследования генетических закономерностей всего организма в целом. Применение данного метода позволило точно диагностировать ряд наследственных заболеваний в рамках пренатального периода. Сущность гибридологического метода: Он был разработан австрийским ботаником и биологом Грегором Менделем. Данный метод позволяет установить закономерности наследования отдельного набора признаков при таком размножении организмов, как половое. Его сущность – проведение анализа наследования по отдельным автономным признакам, которые передаются нескольким поколениям, и точного количественного учета наследования всех альтернативных признаков и характера потомства каждого отдельно взятого гибрида. Он является основой современной генетики. Первый закон Грегора Менделя Он проводил свои опыты с таким самоопыляющимся растением семейства Бобовых, как горох. Для эксперимента Мендель Грегор выбрал его желтые и зеленые семена. Ввиду того что горох размножается самоопылением, изменчивость окраса не наблюдается в пределах одного сорта. Приняв во внимание данное свойство, Мендель Грегор произвел искусственное опыление экспериментального растения посредством скрещивания сортов, семена которых отличаются окрасом. По окончании эксперимента было выявлено, что сорт материнского растения не играет основополагающей роли. Гибриды растений (семена, полученные в результате скрещивания) первого поколения (F1) имели исключительно желтый окрас. Это говорило о том, что у них проявляется лишь один признак (иной родительский признак отсутствует). В связи с этим непроявившиеся признаки у гибридов 1-го поколения биолог назвал рецессивными, а проявившиеся – доминантными (желтый окрас семян доминировал над зеленым). Мендель обнаружил так называемое единообразие окраски гибридов 1-го поколения (они имели идентичную окраску). Второй закон Грегора Менделя Среди гибридов были и желтые, и зеленые семена (6022 шт. желтых, 2001 шт. зеленых, то есть ¾ всех гибридов имели желтый окрас). Таким образом, отношение доминантного признака к рецессивному – 3:1. Данное явление Мендель именовал расщепление признаков. Достоинства рассматриваемого метода Вопрос касаемо сходства родителей и потомков, а также природы постоянно появляющихся изменений волновал не одно поколение людей. Первым начал познавать наследственность уже упомянутый ранее знаменитый исследователь Г. Мендель. Именно он смог очертить значимые законы наследственности. Биолог выявил, что признаки организмов устанавливаются дискретными наследственными факторами. Его работа отличалась математической точностью, но все же она была неизвестна 35 лет. Вновь открытые законы Менделя стали толчком к стремительному развитию науки в области наследственности, изменчивости организмов, которая получила название "генетика". В связи с этим примитивные единицы наследственности, которые располагаются в хромосомах, получили название "ген". Каждый отдельный из них кодирует только одну цепь (полипептидную). Комбинации одного гена именуются аллелями. В процессе полового размножения гаплоидная клетка – гамета - содержит лишь одну вариацию генома (по 1-му аллелю каждого отдельного гена). Она имеет 2-ой набор хромосом (2 аллеля каждого отдельного гена). Гибридологический метод изучения наследственности имеет важные особенности: наблюдение происходит за наследованием контрастных (альтернативных, взаимоисключающих) признаков. К примеру, рост растений: высокие и низкие. Вторая особенность – точный количественный учет пар альтернативных признаков в ряду поколений. Именно математическая обработка полученных данных дала возможность исследователю определить количественные закономерности касаемо передачи анализируемых признаков. Как уже было упомянуто ранее, рассматриваемый гибридологический метод лег в основу современной генетики. Далее опишем его особенности. Гибридологический метод исследования наследственности: отличительные особенности Их три: Тщательный подбор родителей, которые должны различаться по 1-ой, 2-ум, 3-м и т. п. парам альтернативных (контрастных) стабильных признаков. Строгий (точный) количественный учет закономерностей наследования признаков среди гибридов. Индивидуальная оценка каждого потомства (от 2-х родителей) в ряду поколений.

36. Цитогенетический метод исследования и диагностики: принцип метода, значение для клинической диагностики, области использования в биологии и медицине.

Цитогенетический метод изучения наследственности человека представляет собой микроскопический анализ хромосом. С помощью метода осуществляется исследование морфологии человеческих хромосом и их подсчет. Его также используют для культивирования лейкоцитов, чтобы получить метафазные пластинки. Сегодня цитогенетический метод изучения наследственности используется при диагностировании, составлении хромосомных карт, анализа мутационного процесса и решения прочих важных проблем.

Цитогенетический метод диагностики наследственных болезней позволяет установить количественный состав хромосом в ядре клетки и некоторые их морфологические особенности (внешние формы), что имеет решающее значение в диагностике хромосомных болезней. Метод основан на том, что каждая пара хромосом имеет свои особенности, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании клетки в стадию деления. Культуру защитных клеток крови и клеток кожи фиксируют в период наибольшей активности, когда происходит размножение клеток. Их окрашивают, исследуют под микроскопом с большим увеличением, фотографируют хромосомы клеток, ядра которых находятся в стадии деления, вырезают и классифицируют. Дальнейшим анализом устанавливают возможные отклонения в структуре и количестве хромосом. Хромосомный анализ необходим:

1)для уточнения диагноза при наличии у ребенка нечетких клинических признаков, характерных для хромосомного заболевания (болезни Дауна, синдрома Шерешевского-Тернера, Клайнфельтера и др.);

2)при врожденных заболеваниях неясной причины с проявлениями, не вписывающимися в известные синдромы;

3)при повторных спонтанных абортах (выкидышах) в ранние сроки, мертворождениях и если в семье уже есть дети с врожденными пороками развития.

К цитологическому методу исследования относится и исследование полового хроматина, вещества из которого образуются хромосомы. Для этого используется мазок из снятого шпателем верхнего слоя клеток слизистой полости рта (щеки), который окрашивают ацето-орсеином. У нормальных женщин при наличии двух Х-хромосом одна из них во многих клетках принимает функционально пассивное состояние и обнаруживается в отдалении от клеточного ядра в виде интенсивного окрашивающегося основными красителями пятна (тельца Бара), называемого половым хроматином. У мальчиков половой хроматин в норме встречается не более чем в 5% клеток, тогда как у девочек он содержится в 20–70% клеток.

Область применения цитогенетических методов: диагностика наследственной и ненаследственной патологии, изучение мутационного процесса, исследование нормального полиморфизма хромосом, локализация генов.

Значение цитогенетического метода в клинической практике: диагностика хромосомных болезней, диагностика ряда менделирующих заболеваний, проявляющихся изменением хромосом, диагностика онкологических заболеваний и некоторых форм лейкозов, оценка мутагенных эффектов лекарственных препаратов, мониторинг повреждающих воздействий факторов среды.

37.38.39. Генеалогический методисследования и диагностики: принцип метода, значение для клинической диагностики, области использования в биологии и медицине. Условные символы-обозначения. Приведите пример генеалогической карты (родословной) при аутосомно-рецессивных заболеваниях. Приведите пример генеалогической карты (родословной) при аутосомно-доминантных заболеваниях. Приведите пример генеалогической карты (родословной) при заболеваниях, сцепленных с полом.

 

Генеалогический метод диагностики наследственных болезней – один из важнейших методов в генетике, он представляет собой систему изучения заболеваемости в роду с составлением соответствующей родословной. Правильно построенная родословная дает возможность проследить семейные связи, соотношение между лицами женского и мужского пола, заболеваемость и причины смерти отдельных членов семьи в разных поколениях. При генеалогическом исследовании родословная строится не только на основании расспроса, но и на непосредственном обследовании максимально возможного числа родственников. С помощью генеалогического метода можно установить доминантный тип наследования заболевания (у кого он чаще всего проявляется – в некоторых случаях и рецессивный тоже). В этом случае один из родителей также будет страдать данным заболеванием, и будет отмечаться, что это же заболевание имелось у его более отдаленных предков. Если один из родителей при доминантном типе наследования является гомозиготным по данному признаку, то все его дети бывают больными; если родитель является гетерозиготным, что наблюдается чаще всего, то риск рождения больного ребенка снижается в 2 раза. У различных родственников выраженность признаков болезни может быть разной. У отдельных лиц при наличии доминантного измененного гена заболевание может вовсе не проявиться. Такие носители гена остаются практически здоровыми, что связано с неполной распространенностью гена. Выраженность и частота проявлений гена зависят от влияния других генов, перекрывающих неполноценную информацию измененного участка. При рецессивном типе наследования болезни на родословной можно видеть, что одно и то же заболевание обнаруживается только у братьев и сестер больного. У других представителей родословной такого заболевания не отмечается. Родители, как правило, здоровы, но они являются носителями измененного гена, т.е. гетерозиготными. Иногда в таких случаях при составлении родословной удается установить кровное родство родителей. При браках между близкими родственниками (родные брат, сестра) особенно часто встречаются скрытые измененные гены, совмещение которых у ребенка обусловливает развитие наследственного заболевания. При рецессивном наследовании заболеванием в семье может страдать один ребенок из четырех. При исследовании родословных можно заметить, что заболевание, которым страдает ребенок мужского пола, обнаруживается в различных поколениях и только у мужчин, т.е. четко выступает явная передача болезни по наследству у лиц мужского пола. Такое наследование характерно для гемофилии (заболевание крови, при котором нарушается ее свертываемость), цветовой слепоты (дальтонизма) и др. В настоящее время известно более 50 наследственных заболеваний, связанных с полом. Пол определяется половыми хромосомами: женский – хромосомами ХХ, мужской – ХY. Если измененный ген локализуется на Х-хромосоме, то другой, нормальный ген, отвечающий за этот же признак,– на такой же Х-хромосоме у женщины, компенсирует отсутствие или низкую активность фермента, образующегося при считывании информации с измененного участка. Поэтому у лиц женского пола заболевание не проявляется, но 50% женщин такой семьи будут носителями патологического гена, который передадут половине своих сыновей. У лиц мужского пола, получивших от матери Х-хромосому с измененным геном, дефект не возмещается, и у них развивается заболевание.

Значение клинико-генеалогического метода в клинической практике для выяснения природы заболевания, оценки клинических проявлений, дифференциальной диагностики наследственных форм патологии, изучения генетической гетерогенности заболеваний, оценки риска возникновения новых случаев заболеваний в семье, прогноз болезни и жизни.

Медико-генетическое консультирование - специализированный вид медицинской помощи - является наиболее распространенным видом профилактики наследственных болезней. Суть его заключается в определении прогноза рождения ребенка с наследственной патологией, объяснении вероятности этого события консультирующимся и помощи семье в принятии решения о дальнейшем деторождении.

Показаниями для медико-генетического консультирования являются:

1) рождение ребенка с врожденным пороком развития;

2) установленная или подозреваемая наследственная болезнь в семье в широком смысле слова;

3) задержка физического развития или умственная отсталость у ребенка;

4) повторные спонтанные аборты, выкидыши, мертворождения;

5) близкородственные браки;

6) воздействие подозреваемых на тератогенность или известных тератогенов в первые 3 мес. беременности;

7) неблагополучное протекание беременности. В принципе каждая супружеская пара должна пройти медико- генетическое консультирование до планирования деторождения (проспективно) и безусловно после рождения больного ребенка (ретроспективно).

Q-окрашивание. Первый метод дифференциального окрашивания хромосом был разработан шведским цитологом Касперссоном, использовавшим с этой целью флюоресцентный краситель акрихин-иприт. Под люминесцентным микроскопом на хромосомах видны участки с неодинаковой интенсивностью флюоресценции - Q-сегменты. Метод лучше всего подходит для исследования Y-хромосом и потому используется для быстрого определения генетического пола, выявления транслокаций (обменов участками) между Х- и Y- хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, а также для просмотра большого числа клеток, когда необходимо выяснить, имеется ли у больного с мозаицизмом по половым хромосомам клон клеток, несущих Y-хромосому.

G-окрашивание. После интенсивной предварительной обработки, часто с применением трипсина, хромосомы окрашивают красителем Гимзы. Под световым микроскопом на хромосомах видны светлые и темные полосы - G-сегменты. Хотя расположение Q-сегментов соответствует расположению G-сегментов, G-окрашивание оказалось более чувствительным и заняло место Q-окрашивания в качестве стандартного метода цитогенетического анализа. G-окрашивание дает наилучшие результаты при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы).

R-окрашивание дает картину, противоположную G-окрашиванию. Обычно используют краситель Гимзы или флюоресцентный краситель акридиновый оранжевый. Этим методом выявляют различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

С-окрашивание используют для анализа центромерных районов хромосом (эти районы содержат конститутивный гетерохроматин) и вариабельной, ярко флюоресцирующей дистальной части Y-хромосомы.

Т-окрашивание применяют для анализа теломерных районов хромосом. Эту методику, а также окрашивание районов ядрышковых организаторов азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) используют для уточнения результатов, полученных путем стандартного окрашивания хромосом.

Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окрашивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азур-эозином), без какой либо предварительной обработки. Такая окраска приводит к сплошному прокрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы. Рутинная окраска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959–1970 гг., до внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В настоящее время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность.

41. Методы исследования нуклеиновых кислот. Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, в конечном счете, предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат «манипуляции» с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70—80-х годах и последующего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медико-генетическую практику.

Чтобы познакомить с сутью и терминологией молекулярно-генетических методов, ниже схематично описаны их основные этапы и варианты. Освоение этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует спе­циальной подготовки в соответствующих лабораториях.

п олимеразную цепную реакцию(ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция(ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от лат. sequentum — последовательность). В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов^[1][2].

Для секвенирования применяют методы Эдмана, Сэнгера и другие; в настоящее время для секвенирования генов обычно применяют метод Сэнгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи ПЦР. Секвенирование полного генома обычно осуществляют при помощи технологий секвенирования нового поколения (next-generation sequencing).

 

Геном – совокупность всех генов организма, ген состоит из считываемых участков (экзонов) и "молчащих" участков (интронов). Экзоны отвечают за правильное считывание и синтез белков нашего тела, поэтому именно экзом (совокупность всех экзонов) дает нам возможность с большой вероятностью вычислить генетическую ошибку или поломку в организме, если она есть. Секвенирование – это считывание последовательности нуклеотидов в генах. Секвенирование экзома – это процесс распознавания считываемых участков всех генов организма (25 000 генов), что составляет 1,3% от всего генома.

 

Полноэкзомное секвенирование дает:

1. Подтверждение или опровержение клинического диагноза в спорных клинических случаях.
2. Более точное прогнозирование скорости развития заболевания и серьезности осложнений.
3. Степень вероятности передачи заболевания потомкам.
4. Возможность применения в конкретном клиническом случае разрабатываемых таргетных (целевых) молекулярных методов лечения (вирус-векторная терапия, доставка специфических фармакологических агентов (лекарств) и пр.)

Секвенирование нового поколения — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания еепервичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участковгенома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

42.. ПЦР и секвенирования ДНК для идентификации патогенов в клетках эукариот:

⇐ Предыдущая6789101112131415Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: