Экзон- Любой отдельный фрагмент прерывистого гена, который сохраняется в зрелой РНК.

Экзоны (exons) [англ. expressing) zon(e) — экспрессирующаяся область] - нуклеотидные последовательности эукариотических генов, которые кодируют зрелую мРНК. В генах экзоны чередуются с интронами. Участки пре-мРНК, транскрибированные с экзона, как правило, сохраняются при процессинге и образуют в результате сплайсинга зрелую мРНК. Экзоны выполняют три различные функции:

а) функцию лидера — начальные экзоны. гена содержат сигналы для инициации трансляции мРНК;

б) функцию матрицы — экзоны кодируют информацию, которая обеспечивает образование белка на мРНК;

в) терминирующие функции — последние экзоны включают нуклеотидные последовательности, которые в зрелой мРНК являются сигналом для окончания трансляции, а также полиаденилирования мРНК.

Транс-сплайсинг (trans-splicing) [лат. trans — сквозь, через и англ. splice — сращивать, соединять] — сплайсинг (см. Сплайсинг), происходящий между двумя разными молекулами РНК или белка. При Т.-с. РНК сплайсосома (см. Сплайсосома, сплайсома) выбирает для объединения 5'-сайт и 3'-сайты сплайсинга, расположенные на разных молекулах РНК, в результате чего объединяются в одну молекулу нуклеотидные последовательности РНК, транскрибированные с разных генов. В основе Т.-с. РНК лежат те же молекулярные механизмы, которые функционируют при внутримолекулярном сплайсинге. Последовательности нуклеотидов сайтов транс- и цис-сплайсинга идентичны и взаимозаменяемы в генно-инженерных экспериментах. Т.-с. обнаружен у простейших (трипаносом), евглен, нематод и плоских червей, а также в митохондриях, хлоропластах и безрибосомных пластидах высших растений. Т.-с. белка основан на том факте, что при искусственном разделении интеинов (см. Интеин) на две части каждая из них сама по себе не обладает ферментативной активностью, однако после их нековалентного объединения комплекс активируется. При одновременной экспрессии обеих частей интеина в одной клетке происходит спонтанный Т.-с. белков. С помощью Т.-с. белков получают полусинтетические белковые продукты, изучают белок-белковые взаимодействия, осуществляют синтез циклических пептидов и др. Впервые Т.-с. пре-мРНК был описан у трипаносомы В. Мурфи с соавт. в 1986 г.

52. Иммуноферментный анализ. Иммуноблотинг (western blot): принцип метода. Значение для исследований в биологии и значение в диагностике заболеваний.

Иммуноферментный анализ (ИФА) – современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни. Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) Поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;
2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);
3) исследование гормонального статуса пациента;
4) обследование на онкомаркеры;
5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).
2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.
3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:

1) Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя.

Выделяют несколько разновидностей ИФА (прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный), однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Суть метода ИФА

Простым языком этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1) На поверхности лунок планшета доктора, проводящего обследование, находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении биологического материала (сыворотки крови) пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Это соединение будет выступать «особым антигеном» в следующем этапе.

2) На данном этапе идет образование ИК (иммунных комплексов) - реакция между «особым антигеном» и конъюгатом (это иммуноглобулин, меченый ферментом пероксидазой). Добавляется особый хромоген. Результатом такой ферментативной реакции является образование окрашенного вещества в лунке планшета, интенсивность окраски которого зависит от количества содержащихся в материале пациента иммуноглобулинов (антител).

3) Далее происходит оценка результата: фотометрирование с помощью многоканального спектрофотометра, сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб, математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Обычно на практике используют 96 луночные планшеты.

При измерении оптической плотности (ОП) исследуемой жидкости подсчитывается количество (или концентрация) антител в определенной единице объема. Затем результат сравнивается с контрольным образцом.

Нужно помнить: для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии (то есть «референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования. Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При постановке реакций ИФА имеет значение и такое понятие как авидность антител.
Авидность антител – это прочность связи антитела с антигеном и то количество антигена, находящегося во взаимосвязи с иммноглобулинами (антителами). Авидность имеет большое значение при оценке предполагаемого срока инфицирования, что чрезвычайно важно при диагностике первичного инфицирования у беременных.

Основа теста на авидность антител состоит из обработки иммунного комплекса (антиген-антитело) раствором мочевины с целью разрушения белка. Высокоавидные связи остаются целыми, а низкоавидные разрушаются. Результат выдается в виде индекса авидности, выражаемого в процентах (%).

Иммуноблоттинг