 |
Основные принципы генной терапии
|
|
|
|
Лечение гемофилия путем генной терапии подразумевает исправление генетических дефектов больного путём размещения нормально функционирующих генов в его клетки. Нормальные гены, отвечающие за выработку факторов VIII и IX, должны быть внедрёны в достаточное количество клеток, чтобы позволить организму пациента поддерживать необходимый уровень фактора, т. е. излечить его от гемофилии.
Генная терапия - не новое решение, ученые размышляли относительно возможностей генной терапии ещё 30 лет назад, но в то время возникало множество технических препятствий на пути серьезного изучения данного вопроса. Некоторые из этих препятствий были преодолены, другие остаются наряду с возникшими новыми проблемами.
Первоначально, ученые были должны выяснить, каким образом лучше отделить ген от одной клетки и поместить его в другую. Эта проблема была решена многими компаниями и исследовательскими лабораториями, разрабатывающими рекомбинантные препараты, например инсулин, гормоны роста, интерферон и фактор VIII; и учеными, осуществляющими фундаментальные исследования в области генной инженерии. За прошедшие 30 лет, методы извлечения гена и размещения его в клетке получили развитие до такой степени, что теперь эта операция может проводиться в университетских лабораториях и даже некоторых средних школах.
В то время как основы техники по переносу генов легко выполнимы, успешное применение генной терапии требует намного большего, чем обозначено в таблице 1, и имеет некоторые определенные необходимые условия:
1) передаваемый ген должен быть помещен в клетке, где эффективно будет функционировать. Некоторые болезни, например, кистозный фиброз, требуют, чтобы ген был помещен в ткани легких. При гемофилии, ген должен быть помещен в клетки, которые доставят факторы VIII или IX в систему кровообращения.
2) Однажды перенесённый ген должен функционировать в клетке в течение длительного времени, в идеале, постоянно. Или клетки с новым геном, названным приемными клетками, должны самостоятельно выживать в течение длительного времени, или они должны передать ген будущим поколениям клеток. Преследуемая цель не выполнена, если ген, трансплантированный в клетку, погибает в течение короткого промежутка времени.
3) Недавно переданный ген, называемый трансгеном, должен быть должным образом выражен, то есть он должен производить достаточное количество фактора для адекватного свертывания крови.
4) Передача гена не должна повреждать нормальной ДНК. Если ген неправильно введён в ДНК, другие гены могут быть нарушены, или обычно "тихие" гены могут быть возбуждены, что потенциально может приводить к развитию рака и другим аномальным изменениям клетки. Цель состоит в том, чтобы добавить новую способность (вырабатывать фактор) без изменения любых других функций клетки.
5) Передача гена не должна приводить к иммунной реакции, ограничивающей эффективность гена, предотвращая лечение в будущем, или вызывать серьезные побочные влияния.
6) Процесс передачи должен быть един для любых больных гемофилией, относительно прост в применении и эффективен для всех.
|
|
|
Введение генных конструкций, кодирующих факторы роста
Альтернативой терапии рекомбинантными белками может быть генная терапия. Преобладают два типа векторных систем, которые применяются для доставки терапевтического гена в область ишемии: плазмиды и рекомбинантные аденовирусы
В отличие от рекомбинантных белков генетические конструкции работают в ткани-мишени от одной до нескольких недель и обеспечивают менее резкое и более длительное повышение содержания ангиогенного фактора, что позволяет избежать частых и многократных инъекций, что, в свою очередь, позволяет избежать сенсибилизации организма В доклинических исследованиях на животных использование ДНК-плазмид продемонстрировало экспрессию генов продолжительностью от нескольких дней до нескольких месяцев с довольно низкой вероятностью дальнейшей передачи. Данный срок считается сравнительно коротким по сравнению с вирусными векторами, что является фактором безопасности препарата на основе плазмидного вектора. Плазмиды разрушаются внеклеточно, а также внутриклеточно нуклеазами, что обеспечивает локализацию и ограничение процесса во времени. Во время большого числа геннотерапевтических исследований для стимуляции ангиогенеза использовались преимущественно местные введения для достижения максимальной безопасности и эффективности
Использование аденовирусных векторов отличается высокой эффективностью переноса генного материала. Но необходимо учесть, что в организме человека часто присутствуют аденовирусные антитела, снижающие эффективность передачи до уровня в 5 % — уровня, сравнимого тем, который характерен для невирусного переноса генов. Также вирусный перенос генов требует специальных мер биобезопасности, что не является необходимым для невирусных векторов — переносчиков генов. Вопросы безопасности также отражаются в повышенной частоте неблагоприятных явлений в клинических исследованиях с аденовирусными векторами: преходящая лихорадка, повышение С-реактивного белка, ферментов печени и титров аденовирусных антител.
|
|
|
Реализация информации, заключенной в плазмиде или рекомбинантном вирусе происходит в результате синтеза белка. Синтез протекает традиционным путем (транскрипция, трансляция). Образование ангиогенного фактора роста вызывает ряд физиологических изменений, приводящих к росту нового сосуда. В процессе ангиогенеза участвует большое число ангиогенных факторов, но наиболее активным проангиогенным цитокином является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который также является наиболее изученным как в доклинических, так и в клинических исследованиях.
|
|
|
(много воды,нужно выделить главное)
B последнее время появилось целых три новых технологии целенаправленного изменения последовательности ДНК млекопитающих: CRISPR-редактирование, цинковопальцевые нуклеазы (Zinc finger nuclease, ZFN) и TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease). О первом способе мы недавно рассказывали на «Элементах» (см. Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном, «Элементы», 12.03.2013), о двух последних, в особенности о TALEN, речь пойдет ниже.
Пожелавшие остаться неизвестными ученые рассказали сотрудникам новостного отдела журнала Nature, что некоторые научные журналы, которые также пожелали остаться неизвестными, рассматривают в данный момент возможность публикации работ о редактировании генома человеческих эмбрионов.
Эта тема вообще довольно острая и последнее время часто обсуждается. Как водится, сколько ученых – столько и мнений. И, разумеется, свое мнение по вопросу имеют не только ученые. Ажиотаж вызван тем, что появилась возможность. А вот понимания, стоит ли пользоваться этой возможностью, и, если да, то как именно, как часто и для чего – не появилось. На сегодняшний день в странах, где у ученых есть такая техническая возможность, регулирующие органы чаще запрещают подобные эксперименты. Из 22 западноевропейских стран манипуляции с геномом человеческих эмбрионов запрещены в 15. В США прямого запрета нет, но соответствующий комитет Национальных институтов здравоохранения заявил, что не будет в настоящее время принимать к рассмотрению заявки на подобные проекты, а он является основным источником крупных исследовательских грантов в области науки о жизни в США.
Само по себе редактирование геномов не является чем-то неслыханным. Но до сих пор с практическими целями редактировали только геномы человеческих соматических клеток.
Калифорнийская компания Sangamo BioSciences внедряет метод терапии ВИЧ/СПИДа, основанный на модификации генома T-лимфоцитов. Для проникновения внутрь лимфоцита вирусу нужно, чтобы на поверхности лимфоцита находился рецепторCCR5. Существует некоторое количество людей, обладающих этой мутацией от рождения. Такие люди обычно устойчивы к заражению ВИЧ. Симптомы иммунодефицита, вызываемые вирусом, обусловлены тем, что вирус проникает внутрь Т-лимфоцитов и там размножается, а клетки от этого погибают. Резервные копии вируса могут храниться и в других клетках организма, но симптомы болезни обусловлены именно гибелью Т-лимфоцитов. Большинство лимфоцитов живет недолго, их популяция все время обновляется за счет живущих в костном мозге стволовых клеток. Исследователи рассчитывают, что, удалив из стволовых клеток – предшественников лимфоцитов ген, кодирующий CCR5 рецептор, им удастся избавить людей, зараженных ВИЧ, от симптомов болезни. Хотя эти люди, скорее всего, еще долго (возможно, всю жизнь) будут носителями вируса, они смогут обойтись без обладающей неприятными побочными эффектами антиретровирусной терапии, которую иначе вынуждены были бы принимать пожизненно.
|
|
|
В этом году должны начаться клинические испытания лечения β-талассемии с помощью редактирования генома. Эта болезнь вызывается мутацией в гене гемоглобина и может быть вылечена, если исправить ее в стволовых клетках костного мозга – предшественниках эритроцитов.
На сегодняшний день разработаны два принципиально разных метода редактирования геномов. Один создан раньше, зато другой лучше.
Сначала были придуманы генноинженерные нуклеазы. В природе многие клеточные процессы требуют взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. В частности, вся регуляция транскрипции (то есть активности генов) основана на том, что специальные белки взаимодействуют со строго определенными последовательностями ДНК. Обычно за взаимодействие с ДНК в белках отвечают домены, называемые за форму и потребность в атомах цинка для стабилизации структуры «цинковыми пальцами». Поскольку в природе их великое множество, ученым не составило труда научиться конструировать белки, узнающие любую нужную им последовательность ДНК. Объединив домен, ответственный за узнавание ДНК, с доменом, умеющим разрезать ДНК, ученые получили фермент, способный разрезать ДНК в заранее указанном месте.
Более новая технология редактирования генома, использованная впервые с этой целью в 2013 году – это система CRISPR/Cas9. Эта система тоже позаимствована у природы, а точнее у бактерий. У них она работает чем-то вроде приобретенного противофагового (противовирусного) иммунитета. Встретившись с вирусом один раз, бактерия оставляет в своем геноме фрагменты вирусного. С этих фрагментов может синтезироваться РНК с нужными сигнальными последовательностями. Если тот же вирус снова попадет в бактериальную клетку, синтезированная бактерией РНК провзаимодействует с вирусным геномом по принципу комплеметарности, а специальный бактериальный фермент Cas9 умеет разрезать такие взаимодействующие структуры. Если доставить в клетку генетическую конструкцию, кодирующую РНК, комплементарную гену, который нужно исправить, фермент Cas9 и исправленную копию гена, дальше они справляются сами. Этот метод эффективен, прост в использовании и, скорее всего, именно он высек искру, из которой разгорелось пламя революции в области редактирования геномов.
|
|
|
Прежде чем задаваться вопросом, можно ли редактировать геномы человеческих эмбрионов, надо задуматься, нужно ли это.
На самом деле, потребность в таком редактировании возникает на сегодняшний день редко. Если речь идет о том, чтобы не допустить рождения у пары ребенка с генетическим заболеванием, чаще всего, достаточно оплодотворения invitro и последующей селекции эмбрионов. Имплантировать матери будут только те эмбрионы, которые не несут мутации. Возможно, если бы редактирование генома было единственным методом избежать рождения ребенка с болезнью, его разрешили бы быстрее.
Сложно гарантировать, что коррекция генома успеет произойти до момента деления оплодотворенной яйцеклетки (хотя система CRISPR/Cas9 в этом смысле надежнее цинковых пальцев), а если коррекция будет происходить после, то часть клеток может сохранить старый генотип, а часть приобрести новый. Узнать это до рождения ребенка не выйдет, отдаленные последствия этого неизвестны. Возможный мутагенный эффект должен изучаться отдельно, в экспериментах на животных.
Соображения «против» этического плана также довольно сильны. Многим кажется недопустимым, чтобы родители заранее заказывали цвет глаз и свойства характера своих будущих детей.
На сегодняшний день складывается такая картина: редактирование генома человеческих эмбрионов в большинстве стран запрещено, но и не нужно. Возможно, когда мы накопим больше знаний о роли генетики в некоторых заболеваниях, в которых она сегодня не очевидна, и заодно появится больше доказательств безопасности методики, ретрограды, которые считают, что редактирование надо запретить исключительно по этическим соображениям, останутся в меньшинстве
За последние годы в арсенале ученых появилось сразу несколько технологий, позволяющих с легкостью направленно изменять последовательность генома живых организмов, причем не каких-нибудь микробов или мух (это умели делать уже давно), а млекопитающих. Вероятно, не за горами исправление вредных мутаций, приводящих к заболеваниям, и у человека. Однако пока новые технологии проходят проверку на эффективность на мышах. В начале этого года корейские ученые придумали, как использовать метод TALEN — один из способов направленного внесения разрыва в ДНК с последующим его «залечиванием» — для выключения генов у мышей. Сразу после них эту технологию применили для внесения в мышиный геном мутации, приводящей к развитию одного из наследственных синдромов. Авторам метода моделирования генетически обусловленных болезней удалось не только «испортить» мышиный геном, но и исправить его обратно.
51. Посттранскрипционные модификации (post-transcriptional modifications) [лат. post — после и transcriptio — переписывание; лат. modus — мера, вид и facio — делаю] — разнообразные изменения структуры первичных продуктов транскрипции (пре-РНК) до их выхода из ядра; П.м. пре-мРНК включают процессинг, сплайсинг, кэпирование, полиаденилирование и некоторые другие реакции.
|
|
|
