 |
Принцип реализации, значение для научных исследований и клинической практики
|
|
|
|
(конкретные подробные примеры).
Установление первичной структуры ДНК-фрагментов (секвенирование ДНК)
Наиболее часто для установления первичной структуры ДНК используют дидезоксисеквени-рование. В реакционных пробах, содержащих денатурированную однонитевую ДНК, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) - дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ, один из которых является радиоактивным, и праймер инициируют синтез ДНК в присутствии специфических дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддНТФ), или терминаторов, - ддАТФ, ддЦТФ, ддГТФ или ддТТФ. Синтез одновременно ведут в четырёх параллельных пробах, в каждую из которых наряду с компонентами реакционной смеси прибавляют один из 4 ддНТФ. ддНТФ будут конкурировать с нормальными дНТФ за включение в растущую полинуклеотидную цепь. При встраивании ддНТФ вместо соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается. В результате в каждой из пробирок получается набор различающихся по длине меченых фрагментов ДНК с одним из специфических дидезоксинуклеотидов на конце. После одновременного разделения этих фрагментов в электрическом поле на 4 соседних дорожках и радиоавтографии размер синтезированных молекул может быть установлен, а это значит, что может быть определена локализация терминирующих дидезоксинуклеотидов. На основании этих данных устанавливают последовательность нуклеотидов во вновь сингезированных фрагментах, комплементарных ДНК-матрице (рис. 4-64).
В настоящее время создают приборы для автоматического одновременного секвенирования большого числа проб с использованием меченных разными флюорохромами дидезоксинуклеотидов.
В то же время разрабатывают новые, более эффективные и экономичные методы секвенирования. Сущность одного из них заключается в следующем: из 4 нуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) создаётся набор олигонуклеотидов (например, октануклеотидов), включающий все возможные варианты последовательностей. Эти октануклеотиды иммобилизуют (пришивают) в ячейках, в результате чего создаётся так называемая олигонуклеотидная
|
|
|
Рис. 4-63. Блот-гибридизация по Саузерну. Фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза, денатурируют, переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизуют с ДНК-зондом.
Рис. 4-64. Дидезоксисеквенирование последовательности ДНК. Используют 4 пробы, каждая из которых содержит ДНК-матрицу, праймер, ДНК-полимеразу, 4 дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). Праймер либо один из нуклеотидов содержит радиоактивную метку, благодаря чему полосы могут быть обнаружены в геле с помощью радиоавтографии. Один из 4 дидезоксирибонуклеотидов (ддНТФ) добавляют в каждую пробирку. Остановка синтеза происходит в том случае, когда ддНТФ включается в растущую олигонуклеотидную цепь.
матрица. Секвенируемый фрагмент ДНК метят по фосфатному остатку и добавляют в ячейки матрицы. Фрагмент ДНК гибридизуется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Таким образом, определяется набор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в исследуемом фрагменте ДНК. Далее при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение октамеров в исследуемом фрагменте ДНК.
Полимеразная цепная реакция
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 г. Карри Муллисом (Нобелевская премия, 1993 г.), явился эпохальным
Рис. 4-66. Схема клонирования ДНК в бактериальных клетках.
открытием XX века в области молекулярной биологии. Он позволяет подвергать специфичной амплификации в условиях in vitro (в пробирке) участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК. Необходимое условие для проведения ПЦР - знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области. Участок исследуемой ДНК гибридизуют с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями длиной от 15 до 30 пар нуклеотидов, которые комплементарны 3'-концам амплифицируемого участка на кодирующей
|
|
|
и некодирующей нитях ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза продуктов ПЦР используют любой тип ДНК: геномную ДНК человека, различных видов про- и эукариотов, ДНК, выделенную из культур клеток, "библиотек" генов и других источников. Метод не требует больших количеств исследуемой ДНК, в принципе, достаточно даже одной молекулы, содержащейся в одном волосе на голове, одной капле крови или спермы.
Успех в разработке метода в значительной степени обусловлен использованием в качестве фермента термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.
Реакционная смесь для получения интересующей нас ДНК содержит исследуемую ДНК, субстраты реакции - 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную, или Taq-полимеразу и буфер, содержащий ионы Mg2+.
Один цикл полимеризации включает 3 этапа (рис. 4-67):
· плавление: на этой стадии реакционную смесь нагревают до температуры 90-97 °С. Исследуемая двуцепочечная ДНК денатурирует и переходит в однонитевую форму;
· гибридизация или отжиг ДНК с праймерами. В результате снижения температуры до 50-60 °С происходит комплементарное связывание праймеров с цепями матричной ДНК и образование двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК;
· элонгация, удлинение нитей ДНК, комплементарных матричной ДНК, катализирует Taq-полимераза в направлении от 5'- к 3'-концу.
Затем снова наступает этап плавления, когда за счёт повышения температуры синтез ДНК прекращается, и двунитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК денатурирует. Во втором и последующих циклах праймеры гибридизируются с исходной матричной ДНК и с вновь синтезированными молекулами ДНК, количество которых нарастает в геометрической прогрессии. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не из-за изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полиМеразой границы амплифицированного участка, что определяет строго определённый размер продукта с точностью до одного нуклеотида.
|
|
|
Каждый из этапов цикла имеет продолжительность от десятков секунд до 1-3 мин, в результате полный цикл длится от одной до нескольких минут.
Описанную процедуру амплификации ДНК проводят в автоматическом режиме в приборе - циклизаторе, или термоциклере, амплификаторе ДНК. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.
С помощью ПЦР можно получить достаточное количество копий участков ДНК, в которых предполагаются присутствие мутаций, полиморфизм сайтов, можно проводить ДНК-диагностику инфицированности пациентов вирусными, бактериальными и грибковыми возбудителями болезней.
43. Генети́ческая дактилоскопи́я или ДНК-дактилоскопи́я — система научных методов биологической идентификации индивидуумов (организмов) на основе уникальности последовательности чередования нуклеотидов в цепочке ДНК каждого живого существа (за исключением однояйцевых близнецов), своеобразного «генетического отпечатка», остающегося индивидуальным и неизменным на протяжении всей жизни индивидуума (организма)[1][2].
Метод открыт 10 сентября 1984 года британским генетиком Алеком Джеффрисом[1]. Используется во всём мире преимущественно в криминалистике при проведении судебно-медицинских экспертиз для раскрытия самых разных преступлений, а также для установления родства и решения множества других задач, связанных с идентификацией личности[3].
Сегодня ДНК-дактилоскопия проводится даже в портативных лабораториях, и десятки предприятий в мире выпускают оборудование для геномной идентификации личности
|
|
|
