 |
2.3. Полный анализ крови. 2.4. Быстрый тест агглютинации на предметном стекле. 2.5. Реакция сывороточной агглютинации. 2.5.1. Приготовление соматического антигена
|
|
|
|
2. 3. Полный анализ крови
Полный анализ крови дает быстрый результат в отношении птичьего тифа и пуллороза, что можно использовать на сельскохозяйственных предприятиях. Чувствительность полного анализа крови невелика, поэтому в неопытных руках могут быть зарегистрированы как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Подробное описание полного анализа крови представлено в главе 2. 3. 11.
2. 4. Быстрый тест агглютинации на предметном стекле
Сыворотку (0, 02 мл) смешивают с поливалентным антигеном, окрашенным кристаллическим фиолетовым (0, 02 мл). Планшет осторожно покачивают в течение 2 минут, а затем считывают результат теста. Компоненты анализа хранят при 4°C и перед использованием доводят до комнатной температуры.
Испытуемые сыворотки должны быть свободными от загрязнений и продуктов гемолиза. Образцы сыворотки, которые какое-то время хранились, полезно центрифугировать.
Если возникает подозрение на неспецифические ложноположительные реакции, то положительные/подозрительные сыворотки можно проверить повторно после термической инактивации при 56°C в течение 30 минут.
2. 5. Реакция сывороточной агглютинации
Реакция сывороточной агглютинации (РСА) не очень чувствительна, и у многих животных старшего возраста могут наблюдаться низкие уровни сывороточных агглютининов за счет других энтеробактерий кроме Salmonella. Единичные образцы не имеют существенной диагностической ценности кроме случаев первичного скрининга на основе материала из стада. Минимальным требованием для подтверждения активной инфекции являются парные образцы. Этот анализ относительно недорог: антигены можно приготовить достаточно просто, а дорогостоящее оборудование не требуется. РСА можно адаптировать к формату микротитрования и достаточно просто использовать для определения соматических и жгутиковых титров. Целесообразно использовать стандартные сыворотки и другие подтверждающие методы для контроля качества в отношении чистоты и иммуногенности антигенного препарата (препаратов) для РСА, что не зависит от сывороток, полученных при помощи этих антигенов. Данный метод был использован для идентификации контакта с разными сероварами Salmonella, например, S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Dublin, S. diarizonae у индюков и S. Abortusequi.
|
|
|
2. 5. 1. Приготовление соматического антигена
i) Берут пробу из соответствующей исходной культуры Salmonella для пересева в чашку с основой кровяного агара (ОКА) или другой подходящей средой для роста единичных колоний. Материал инкубируют в течение ночи при 37°C (±2°C).
ii) Выбирают гладкую колонию S-типа и проводят анализ методом агглютинации на предметном стекле, чтобы подтвердить присутствие необходимого соматического антигена.
iii) Используя стерильную петлю, засевают наклонный питательный агар в универсальном контейнере материалом из выбранной колонии.
iv) Культуру инкубируют 8–12 часов при 37°C (±2°C).
v) При помощи пастеровской пипетки отмывают культуру, предпочтительно, в ламинарном шкафу, используя приблизительно 2 мл абсолютного спирта, и переносят материал в стерильный универсальный контейнер.
vi) Антиген оставляют на 4–6 часов при комнатной температуре, чтобы спирт убил бактерии и отделил жгутики.
vii) Универсальный контейнер раскручивают в настольной центрифуге в течение 5 минут с ускорением 1000 g. Жидкость отливают и добавляют достаточное количество солевого раствора фенола, чтобы довести антиген до эквивалента непрозрачности в пробирке Брауна № 2 (приблизительно 10 колониеобразующих единиц/мл), или используя другой подходящий стандарт.
|
|
|
viii) Выполняют стандартное титрование с известной сывороткой, чтобы убедиться в наличии положительного антигена для необходимого фактора.
ix) Материал хранят в холодильнике при температуре 4°C до момента его использования.
2. 5. 2. Приготовление жгутиковых антигенов
i) Делают отбор пробы из соответствующей исходной культуры Salmonella для пересева в чашку с ОКА или другой подходящей питательной средой. Материал инкубируют в течение ночи при 37°C (±2°C).
ii) Делают посев на полутвердый агар (приблизительно 0, 3%) в пробирке Крейги или в другом подходящем контейнере, чтобы индуцировать оптимальную экспрессию соответствующего жгутикового антигена. Если в материале представлен двухфазный серовар, то к агару добавляют H-антисыворотку, соответствующую той фазе, которую надо подавить.
iii) Чтобы проверить и подтвердить нужную фазу жизненного цикла Salmonella, используют агглютинацию на предметном стекле. Если все правильно, то петлю с культурой погружают в 20 мл питательного бульона. Для оптимального роста бактерий материал инкубируют в течение 12–18 часов при 37°C (±2°C). Если бактерии находятся в неправильной фазе, то делают повторный пассаж через полутвердый агар.
iv) 250 мкл 40% формальдегида пипетируют в суспензию антигена (надо использовать перчатки и предпочтительно работать в ламинарном шкафу), после чего оставляют материал на ночь.
v) Антиген проверяют методом РСА, используя соответствующую типирующую сыворотку.
|
|
|
