1.1. Культура. 1.1.1. Среды для предварительного обогащения. 1.1.2. Селективные обогащающие среды

1. 1. Культура

Существуют многочисленные методы для выделения и обнаружения Salmonella, которые широко используются во всем мире (Fricker, 1987; Harvey & Price, 1974; Lee et al., 2015; Park et al., 2014; Reissbrodt, 1995). Некоторые из общепринятых методик описаны ниже. Методики культивирования и питательные среды, которые способны лучшим образом работать в конкретной диагностической ситуации, зависят от множества факторов, включая серовар Salmonella, источник получения и тип образцов, вид животных, от которых исходит инфекция, опыт микробиолога и доступность селективных сред для обогащения культур и выделения искомых бактерий.

Все приготовленные культуральные среды должны проходить контроль качества и обеспечивать рост подозрительного микроорганизма из небольшого количества посевного материала в присутствии релевантной матрицы проб. Рутинное использование эталонного штамма параллельно с обычными образцами при небрежных методиках может привести к перекрестной контаминации образцов. Поэтому следует использовать редкий серовар с типичными характеристиками роста, который сходен с наиболее приоритетными целевыми штаммами. Кроме того, можно использовать штаммы с резистентностью к противомикробным препаратам или с другими маркерами, например, с флюоресценцией.

Растущее применение внешних программ гарантии качества привело к большему методическому использованию международных стандартов, таких как ISO 6579: 2002, даже при том условии, что этот метод не был аттестован для образцов фекалий и материала из окружающей среды, а был предназначен для продуктов питания и кормов для животных (ISO, 2002). Был опубликован стандартный метод для выявления Salmonella в первичной продукции животноводства, и настоящее время принят метод ISO (ISO, 2007). Основу для стандартного метода составляет предварительное обогащение в забуференной пептонной воде с последующим обогащением на модифицированной полутвердой среде Раппопорта-Вассилиадиса (MSRV) и выделением на ксилозо-лизиновом агаре с дезоксихолатом (XLD) и дополнительной наиболее эффективной плоской чашечной среде. Также было показано, что этот метод очень эффективен для исследования животных кормов, образцов окружающей среды для животных и мясных продуктов, причем он проще и дешевле, чем полный метод ISO. Диагностические методы и анализы должны быть аттестованы, как это описано в главе 1. 1. 6 Принципы и методы валидации диагностических наборов для анализа инфекционных заболеваний.

1. 1. 1. Среды для предварительного обогащения

Количество сальмонелл в фекалиях от бессимптомных животных, в образцах из окружающей среды, в кормах для животных и в пищевых продуктах обычно невелико, что нередко заставляет использовать специальные среды для предварительного обогащения (например, буферизованную пептонную воду), чтобы облегчить выделение нужного штамма. Это позволяет размножиться небольшому количеству сальмонелл, которые в противном случае погибли бы из-за токсического эффекта селективной питательной среды, и помогает восстановить сублетально поврежденные сальмонеллы, например, в результате замораживания, нагревания, высыхания, а также воздействия

антисептиков или органических кислот (Harvey & Price, 1974). Для тех животных, которые лишь периодически выбрасывают сальмонеллы с фекалиями, целесообразно анализировать, по меньшей мере, три последовательных образца фекалий.

1. 1. 2. Селективные обогащающие среды

Обогащающие среды представляют собой жидкие или полутвердые агары, содержащие добавки, которые избирательно позволяют размножаться сальмонеллам, но подавляют рост других бактерий. Примерами селективных обогащающих сред являются тетратионат в бульоне Мюллера-Кауфмана, селенит-цистеиновый бульон, бульон с бриллиантовым зеленым, бульон Раппопорта-Вассилиадиса и модифицированный полутвердый агар Раппопорта-Вассилиадиса (MRSV). Однако некоторые добавки также относительно токсичны по отношению к определенным сероварам Salmonella, например, селенит подавляет S. Choleraesuis, а бриллиантовый зеленый токсичен для многих штаммов S. Dublin. Для увеличения селективности также была использована повышенная температура, например, 43°C в некоторых лабораториях, хотя это воздействие может быть ингибирующим в комбинации с некоторыми средами, например, содержащими тетратионат. В средах Раппопорта-Вассилиадиса при 43°C подавляется рост термочувствительных штаммов, особенно S. Dublin, поэтому в настоящее время для инкубации в средах на основе бульона Раппопорта-Вассилиадиса рекомендуется температура 41, 5°C. Для того чтобы увеличить чувствительность процедуры выделения Salmonella обычно используют селективные обогащающие среды для определения подвижности, такие как MSRV или диагностическая полутвердая среда для Salmonella (DIASALM) (Voogt et al. , 2001). Рекомендуется использовать, по меньшей мере, два обогащающих бульона, причем один инкубируют при 37°C, а другой более высокой подходящей температуре. Рецептурный состав среды, который может изменяться в зависимости от поставщика, а в некоторых случаях даже в разных партиях, температура и продолжительность инкубации, а также объем образцов, используемых для засева среды, могут повлиять на эффективность выделения, следовательно, эти переменные всегда необходимо принимать во внимание. Для лучшего выделения Salmonella из образцов с ограниченным содержанием железа или питательных веществ, например, из яиц, воды или почвы, можно добавлять к селективным средам такие аддитивные компоненты как ферриоксамин E (Reissbrodt, 1995), кроме того, для подавления роста большинства грамположительных микроорганизмов или других грамотрицательных бактерий, например, Proteus, можно добавлять такие антибиотики, как новобиоцин. Для лучшего выделения штаммов Salmonella, обладающих резистентностью к антибактериальным средствам, можно добавлять специфические антибиотики.