1.1.3. Селективные плоские среды

1. 1. 3. Селективные плоские среды

Эти среды представляют собой твердые селективные агары, в различной степени создающие условия для дифференциального роста. Они подавляют рост других бактерий кроме Salmonella и дают информацию о некоторых из основных дифференциальных биохимических характеристик: обычно о нелактозном сбраживании и выработке сероводорода (H2S). Результаты считывают через 24 и 48 часов культивирования при 37°C. На таких средах сальмонеллы образуют характерные колонии, которые, как правило, отличимы от колоний других бактерий на плоской среде за возможными исключениями Proteus, Pseudomonas, Citrobacter и Hafnia. Иногда можно выделить сальмонеллы, ферментирующие лактозу, а выработка H2S может варьироваться. Эффективное обнаружение таких атипичных штаммов возможно при использовании полутвердых сред, позволяющих определить подвижность. В качестве примера можно привести модифицированные полутвердые среды MSRV и DIASALM. Селективность этих сред основана на подвижности микроорганизма, присутствии красителя «малахитовый зеленый» и новобиоцина, а также на высокой концентрации хлористого магния. Полутвердая среда позволяет обнаружить подвижность по наличию ростового

гало на далеком расстоянии от места посева. Среда DIASALM особенно полезна для выявления атипичных штаммов, поскольку можно получить предположительное подтверждение посредством реакции агглютинации на предметном стекле с использованием поливалентного O, H, или специфических антисывороток на жидкости из зоны роста на агаре. Кроме того, можно использовать такие плоские среды как цитратный агар с дезоксихолатом натрия (DCA), агар с бриллиантовым зеленым (BGA) или висмут-сульфитный агар, но эти среды чаще дают рост ложноположительных колоний. Salmonella Abortusovis – это медленно растущий серовар, и обычно чашки с посеянным материалом инкубируют до 72 часов, используя неселективный кровяной агар. Примерами селективных плоских сред являются BGA, агар XLD, DCA и висмут-сульфитный агар. В настоящее время доступен широкий спектр хромогенных агаров типа агара Рамбах (Rambach®) и среды SMID (агар для выявления и идентификации Salmonella). Многие из них могут помочь в дифференциации подозрительных колоний, но они должны быть аттестованы для матриц проб, систем культивирования и целевого диапазона сероваров, поскольку в некоторых ситуациях их чувствительность может оказаться плохой. Однако некоторые хромогенные агаровые среды, такие как Brilliance или Rapid, могут быть более эффективными для обнаружения биохимически атипичных сальмонелл.

1. 1. 4. Типовые методики для выделения бактерий Salmonella из пищи, кормов, фекальных и внешнесредовых образцов

i) 10–25 граммов образца добавляют к × 10 объему забуференной пептонной воды при комнатной температуре. (NB: для многих адаптированных к хозяину сероваров и некоторый сероваров arizonae, предпочтительно добавлять образец к селективной обогащающей среде, такой как селенит-цистеиновый бульон, и, по возможности, анализировать тканевые образцы [включая прямой посев в чашки]; см. метод культивирования для S. Pullorum/Gallinarum в главе 2. 3. 11 Птичий тиф и пуллороз).

ii) Забуференную пептонную воду в инкубируют в течение 16–20 часов при 37°C.

iii) 20 мл среды MSRV или DIASALM в чашке Петри засевают 0, 1 мл инкубированной забуференной пептонной воды.

iv) 10 мл, бульона Мюллера-Кауфмана с тетратионатом засевают 1 мл бульона с инкубированной забуференной пептонной водой.

v) Среду MSRV or DIASALM инкубируют при 41, 5°C, а бульон с тетратионатом при 37°C (убедитесь в том, что Вы используете бренд тетратионата с высокой репутацией, подходящий для инкубации при температуре 37°C).

vi) После 24 и 48 часов селективного обогащения, делают отбор культуры со среды MSRV или DIASALM, взяв петлей 1 мкл материала с края мутной зоны роста и сделав посевную штриховку на чашке с хромогенным агаром (например, агаром Рамбах) или со средой BGA и новобиоцином и еще на одной чашке с агаром XLD.

vii) Делают посев 10 мкл бульона с тетратионатом на одну чашку с хромогенным агаром (например, агаром Рамбах) или со средой BGA и новобиоцином и агаром XLD.

viii) Чашки инкубируют при 37°C в течение 24 часов.

ix) Биохимически проверяют до пяти подозрительных колоний (красных/розовых с покраснением среды на чашке с BGA, темно-красных с бледными границами или оранжевыми/бесцветными на агаре Рамбах, красных с черным центром (или иногда прозрачных красных для штаммов, негативных по H2S) на агаре XLD), используя сложные составные среды, такие как TSI, LDC с мочевиной, или применяя коммерческие биохимические тесты. Уровень серогруппы подтверждают, применяя поли-O и поли-H антисыворотку (фаза 1 и фаза 2) или составные биохимические среды. Одного

серогруппирования недостаточно из-за перекрестных реакций с поливалентными сыворотками, например, у подвидов Citrobacter. Подтверждение можно получить при помощи различных биохимических тестов.

x) Очень подозрительные колонии, не дающие агглютинации с поли-H антисыворотками на неселективных средах, субкультивируют, после чего тестирование повторяют. Если удается получить выраженную поли-O и поли-H агглютинацию, то этого достаточно для предположительного подтверждения. Биохимически и серологически подтвержденные культуры можно направить в референтную лабораторию для серотипирования. Если результаты теста на агглютинацию неясны, то выполняют дальнейшее биохимическое тестирование, используя составные среды, например, такие как TSI, ONPG с мочевиной, или коммерческие наборы для биохимического тестирования.

Этот метод отличается от ISO 6579: 2002 и метода, описанного в его приложении D, в том отношении, что он допускает засев среды DIASALM вместо MSRV для селективного обогащения и использует хромогенный агар Рамбах в качестве первого плоского агара. Однако он дает дополнительную возможность выявления, комбинируя элементы обогащения в бульоне и на полутвердом агаре (Carrique-Mas et al., 2009).