1.2. Методы количественного анализа

1. 2. Методы количественного анализа

Количественное содержание Salmonella в инфицированных тканях можно определить прямым посевом, но для анализа фекальных, пищевых/кормовых или внешнесредовых образцов необходимы методики наиболее вероятного количества (MPN). Был описан миниатюризированный метод MPN (ISO, 2012) (Fravalo et al. , 2003). Кроме того, были разработаны методы количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

1. 3. Идентификация подозрительных колоний

Подозрительные колонии субкультивируют на селективных и неселективных агарах для того, чтобы убедиться в отсутствии возможных загрязнителей, например, подвидов Proteus. Если развивается обильный чистый рост, то подозрительные колонии можно проверить реакцией агглютинации на предметном стекле с поливалентными антисыворотками для типирования Salmonella (Ellis et al. , 1976). В некоторых случаях подозрительная колония может не давать агглютинации или давать аутоагглютинацию, что заставляет применять биохимические тесты для подтверждения идентичности. Эти тесты могут быть выполнены, используя сахара пептонной воды или коммерческие системы; кроме того, для скрининга микроорганизмов можно использовать составные среды (такие как трехсахарный железосодержащий агар [TSI]) (Ewing, 1986). Особенно важно убедиться в том, что культуры Salmonella, используемые для определения резистентности к противомикробным препаратам, не имеют примесей других микроорганизмов, таких как Pseudomonas, которые вполне могут быть мультирезистентными. Приемлемым методом для идентификации Salmonella также является MALDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы).

Выявление фактора (факторов) O, антигена (антигенов) H, и в особых ситуациях антигена Vi, характерного для S. Typhi, S. Paratyphi C и S. Dublin, проводят методом прямой агглютинации на предметном стекле или агглютинации в пробирке с применением определенных антисывороток. Применительно к двухфазным микроорганизмам необходимо определить обе фазы при помощи фазовой инверсии. Это подразумевает пересев через полутвердый агар, содержащий иммунную сыворотку для известной фазы. Скрининг облегчается за счет доступных антисывороток, направленных против нескольких факторов, которые можно исследовать далее при помощи

моновалентных типирующих сывороток. Имеется подробное описание серотипирования Salmonella (ISO, 2014; Grimont & Weill, 2007). Хотя многие лаборатории могут идентифицировать более распространенные серовары, обычно приходится использовать возможности референтной лаборатории, чтобы подтвердить идентичность выделенной культуры, включая фаготипирование (при доступности фагов, специфичных в отношении различных сероваров), а также для получения генетических характеристик.

Для определения некоторых вариантов сероваров могут потребоваться дополнительные биохимические анализы, например, сбраживание d-тартрата, которое используют для дифференциации варианта Java S. Paratyphi B (d-тартрат +) от S. Paratyphi B. Выделенные культуры также необходимо анализировать на чувствительность к ряду противомикробных средств, поскольку возрастает озабоченность по поводу появления новых мультирезистентных штаммов, содержащих в своем геноме передаваемые следующим поколениям гены резистентности к цефалоспоринам и фторхинолонам (Figueiredo et al., 2015; Greene et al. , 2008). Живые вакцинные штаммы также обычно идентифицируют по маркерам резистентности к противомикробным препаратам, биохимическим изменениям, таким как ауксотрофия или погрешность.

1. 4. Иммунологические и основанные на нуклеиновых кислотах методы распознавания

В практике используются многочисленные альтернативные методы выявления Salmonella, причем некоторые из них имеются в продаже. Они включают иммуномагнитную сепарацию (IMS) (Park et al. , 2011), ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени (Park et al. , 2014), твердофазный иммуноферментный анализ (твердофазный ИФА) (Barrow, 1992; Wang et al., 2015), ПЦР в режиме реального времени (Malorny et al., 2004), количественную ПЦР (Piknova et al. , 2005) и микроматричный анализ (Porwollik et al., 2004; Rasooly & Herold, 2008). Эти методы можно использовать для идентификации специфических сероваров Salmonella (Maurischat et al., 2015a) или для дифференциации между живыми вакцинными штаммами и сероварами Salmonella, инфицирующими животных и птиц (Maurischat et al., 2015b). Некоторые методы являются комбинированными и состоят из таких элементов, как двухступенчатое обогащение и ПЦР в режиме реального времени (Krascseniscova et al. , 2008). Многие из этих методов не были полностью аттестованы для применения на фекальных и внешнесредовых образцах, хотя общий прогресс очевиден (Eriksson & Aspan, 2007; Malorny & Hoorfar, 2005). Эти методы в большей степени подходят для анализа продуктов питания человека, когда обеспечение ингибиторами ПЦР не так проблематично, как при анализе фекалий (Kanki et al. , 2009), хотя есть потенциал для применения в этом тесте быстрых методов, а также для выпуска партий животных кормов без Salmonella. Применение быстрых методов обычно обходится дороже, чем традиционное культивирование, но могут быть экономически доступными для начального анализа материалов скрининга, где ожидается низкий риск загрязнения или отрицательный результат анализа таких материалов, как корма для животных. Метод обогащения/IMS в сочетании с твердофазным ИФА или ПЦР позволяет идентифицировать большую часть загрязнений материала Salmonella в течение 24 часов. Поскольку в настоящее время ни один из быстрых методов не продемонстрировал способности к прямому выявлению Salmonella, требуются стадии неселективного или селективного обогащения (Oliveira et al. , 2003). Как правило, для этого требуется большее число этапов и большие затраты времени оператора в процедуре выявления. Для методов на основе анализа ДНК ингибирование ПЦР элементами матрицы испытуемого образца, особенно в случае фекалий, создает проблему, то есть, требуются надежные методики выделения ДНК и средства контроля, способные выявить ингибирование реакции, которое может в некоторых случаях уменьшить чувствительность анализа (Jensen et al., 2013). Существует много вариантов и разработок

в области быстрых методов выявления Salmonella, но до сих пор ни один такой метод при всех обстоятельствах не был способен удовлетворительно заменить культивирование. В отличие от этого, молекулярные методы серотипирования или субтипирования культур Salmonella, используются все более и более широко (EFSA, 2013), и некоторые наборы, в которых используются эти методы, пригодны для применения в небольших лабораториях, не располагающих всеми возможностями референтной лаборатории. Важно, чтобы используемые наборы были полностью аттестованы в соответствии с главе 1. 1. 6. Предпочтительно выбирать наборы, перечисленные в регистре МЭБ (см. http: //www. oie. int/en/our-scientific-expertise/certification-of-diagnostic-tests/the-register-of-diagnostic-tests/).