Разделение связанного и свободного гормона

Существуют различные способы разделения связанного с антите­лами и свободного гормона. В системах для полипептидных гормо­нов обычно применяют «методику вторых антител». Поскольку исходный комплекс гормона с антителом растворим, с помощью простого центрифугирования разделить связанный и свободный гормон невозможно. В связи с этим после достижения равновесия между гормоном и первыми антителами добавляют вторые антите­ла, полученные на g-глобулин животного того вида, у которого получали первые антитела. Поскольку вторые антитела будут те­перь связывать образовавшийся комплекс между гормоном и пер­выми антителами, то возникнет вторичный нерастворимый моле­кулярный комплекс, и связанный свободный гормон можно будет отделить простым центрифугированием. Например, если антите­ла к гастрину вырабатывались у кролика, то вторые антитела к кроличьему g-глобулину следовало бы получать у животного дру­гого вида (лошади, овцы или козы). Лошадиный антикроличий глобулин нужно было бы добавить в пробирку для анализа после установления равновесия в реакционной смеси, содержащей мечен­ный ^125I гастрин и кроличью антигастриновую сыворотку. Время, необходимое для установления равновесия реакции со вторыми антителами, зависит от концентрации кроличьей сыворотки-носи­теля в реакционной смеси. Например, если первые антитела к гас­трину получены от кролика, в пробирку для анализа можно допол­нительно добавить кроличью сыворотку-носитель или глобулин. Если кроличья сыворотка-носитель занимает 2% объема пробир­ки, то для осаждения кроличьего g-глобулина следует добавлять относительно большой объем вторых антител (0,05—0,2 мл). Поскольку равновесие достигается за время, определяемое первым законом действующих масс, то оно должно достигаться относи­тельно быстро (за несколько часов). Это время вначале находят эмпирически и подбирают необходимый наименьший оптимальный объем вторых антител для каждой их партии, получаемой в лабо­ратории или от торговых фирм. В пробирки для анализа можно добавлять меньшие концентрации сыворотки- носителя, что умень­шит необходимый объем вторых антител, но увеличит время, тре­буемое для достижения равновесия реакции с их участием.

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ЭНДОГЕННЫЕ АНТИТЕЛА

Если в сыворотке больного присутствуют эндогенные антитела, то при определении, проводимом с помощью метода двойных анти­тел, могут быть получены завышенные результаты. Теоретически меченый гормон, добавленный в пробирку для анализа, свяжется либо с антителами больного, содержащимися в пробе сыворотки, либо с антителами, вносимыми в пробирку. Будучи получены на g-глобулин животного, у которого вырабатывали первые антитела, вторые антитела не должны осаждать гормон, связанный с g-глобулином человека, который останется в виде растворимого ком­плекса в супернатанте. В связи с этим осадок будет обладать мень­шей радиоактивностью, что отразит меньшее содержание связан­ного гормона. Поскольку концентрация гормона в пробе обратно пропорциональна количеству осажденного меченого гормона, то результат определения концентрации гормона окажется ошибочно завышенным. Все это схематически изображено на рис. 5—4. Циркулирующие антитела обычно встречаются у больных диабетом, леченных инсулином. Если у больного подозревают присутствие таких антител, то для разделения связанного с антителами и сво­бодного гормона следует применять не метод вторых антител, а какой-либо иной метод. Этого можно достичь различными путями, в том числе осаждением g-глобулином человека или сульфатом аммония. Для точного определения количества антител к данному гормону в пробе сыворотки больного существует ряд дополнитель­ных приемов.

Рис. 5—4. Схематическое изображение типичной радиоиммунологической реакции с двойными антителами (а). Наряду с добавленными в качестве известного реагента антителами в пробе присутствуют и эндогенные анти­тела к гормону (б). Эндогенные антитела искажают результаты определе­ния концентрации гормона в системе двойных антител, поскольку некото­рые комплексы гормон — антитело не осаждаются вторыми антителами, взаимодействующими с кроличьим (но не человеческим) g-глобулины.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДОВ

Стероидные гормоны обычно содержатся в сыворотке в связанном с различными белками виде. Поскольку сывороточные белки могут обладать сродством к гормону, сходным со сродством антител, используемых в радиоиммунологическом анализе, то чтобы по­следний дал надежные результаты, гормоны нужно сначала экс­трагировать, т. е. отделить от сывороточных белков. До широкого распространения радиоиммунологических методов кортизол и дру­гие сходные стероиды, которые ассоциируются с кортизолсвязывающим глобулином (КСГ), определяли методами конкурентного белкового связывания, в которых использовали этот белок-переносчик. В настоящее время такой подход применяют реже, поскольку при этом приходится характеризовать каждую партию сыворотки, из которой извлекают КСГ, и требуется более детальное разделение стероидов с помощью тонкослойной хроматографии. Необходимость всех этих начальных этапов исследования, требующих дополни­тельного времени, а также более широкий разброс результатов от анализа к анализу отодвинул данный метод на второй план по отношению к радиоиммунологическому.

Наиболее распространенным средством разделения связанных с антителами и свободных стероидных гормонов является покрытый декстраном уголь. Он адсорбирует стероиды, не связанные с анти­телами, и переводит их в осадок. Растворимый же комплекс гор­мон—антитело остается в супернатанте. В системах определения стероидов, в которых используется гормон, меченный тритием, супернатант можно декантировать в сосуд, содержащий жидкий сцинтиллятор. В некоторых системах определения стероидных гормонов используют меченые тирозилированные стероиды. В этих случаях разделение связанного и свободного гормона проводят обычно методом двойных антител.