 |
Методы создания клеточных культур растений
|
|
|
|
Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на исследовании такого важного свойства растительной клетки, как тотипотентность (свойство клетки реализовывать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма). В экспериментальных условиях при выращивании эксплантов возможна реализация супрессированной (подавленной) в естественных условиях тотипотентности под действием фитогормонов.
Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.
Основным типом культивируемой растительной клетки
является каллусная.
Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возникающей под действием «раневых гормонов» путем неорганизованной пролиферации дедифферен-цированных клеток при исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает травмированное место, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или генерации утраченного органа.
Образование каллуса не всегда связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза из-за нарушения гормонального баланса. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности.
Каллус на травмированной
виноградной лозе
Культура каллусных клеток – это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллуные, т.е. дифференцируются.
|
|
|
Значительно реже культивируют клетки опухолей растений различного происхождения (растительные – бактериальной или вирусной этиологии; генетические, возникающие на межвидовых гибридах). Культуры опухолевых клеток независимо от способа культивирования на уровне морфологии мало отличаются от культур каллусных клеток. Значительным их физиологическим отличием является гормононеза-висимость, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Однако опухолевые клетки лишены способности давать начало нормально организованным структурам. В некоторых случаях они способны образовывать тератомы.
Каллусные клетки способны делиться только при наличии в питательной среде фитогормонов. Однако при длительном культивировании в некоторых случаях они могут утрачивать зависимость от наличия в среде ауксинов и цитокининов. Природа такой независимости к фитогормонам, чаще всего применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя как опухолевые, при эпигенетической они могут утрачивать признак в ряду превращений клетка-растение-клетка. Такие клетки принято называть «привыкшими». В них также как и в опухолевых клетках идет интенсивный синтез собственных гормонов. Часто ткани, образованные «привыкшими» клетками, называют химическими опухолями. Подобно опухолевым, такие ткани не способны к нормальной регенерации и образуют тератомы.
Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри.
|
|
|
Экспланты
Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Растительные ткани сами по себе могут являться серьезным источником контаминации вследствие присутствия эпифитной микрофлоры. Поэтому до извлечения экспланта часть растения предварительно промывают водой с детергентом, а затем ополаскивают стерильной водой. Затем выделенные экспланты помещают в стерильные растворы, содержащие хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты. После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе их несколько раз промывают стерильной дистиллированной водой и скальпелем стерильно удаляют на срезах несколько слоев клеток.
В некоторых случаях (в основном у тропических и субтропических растений) может встречаться и внутреннее инфицирование тканей. В этом случае принято использовать антибиотики, хотя это и не всегда позволяет получить стерильный эксплант.
Процессу образования каллуса предшествует дедиф-ференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток.
Основным условием превращения растительной клетки в каллусную является присутствие в питательной среде фитогормонов. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, готовящие ее к делению, а цитокинины – пролиферацию дедифференцированных клеток. Если эксплант, состоящий из дифференцированых клеток, поместить в питательную среду без гормонов, деление клеток не произойдет, и каллус не образуется. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с возобновлением под влиянием фитогормонов клеточного деления.
В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), ά-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилмасляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг/л в зависимости от вида экспланта.
Для возбуждения процессов подготовки к делению достаточно начального кратковременного действия ауксина. Поэтому процессы, происходящие в клетках под влиянием ауксина, можно разделить на первичные, непосредственно индуцированные ауксином, и вторичные, являющиеся следствием первичного индуцирующего действия.
|
|
|
В качестве цитокининов применяют зеатин, кинетин и др.
В клетках экспланта, состоящего из неделящихся специализированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно применять прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение нескольких суток (3-6). Это позволяет исключить не только изменения, связанные с травмой, но и возможное неконтролируемое влияние эндогенных гормонов эксплантанта на изучаемые процессы.
Процесс перехода к каллусному росту начинается с остановки клеточных делений. Лаг-фаза продолжается 24-48 часов, в течение которых клетки увеличиваются в размерах и ткань экспланта разрыхляется. Далее клетки начинают быстро делиться, образуя каллусную ткань.
В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают белки, характерные для фотосинтезирующих клеток.
В клетках каллусной ткани происходят не только биохимические, но и цитологические изменения. Через 6-12 часов после индукции дедифференцировки клеточная стенка разрыхляется и набухает, увеличивается число свободных рибосом, элементов аппарата Гольджи, а также изменяются число и размеры ядрышек. Все это предшествует началу процессов деления, которые начинаются через 48-72 часа.
Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки. Однако клеточный цикл у каллусных клеток более длителен.
Их характерной особенностью является выраженная гетерогенность по возрасту в пределах каллусной ткани.
Они потребляют меньше кислорода по сравнению с нормальными клетками, что свидетельствует о снижение эффекта Пастера.
|
|
|
Клетки каллусной ткани также обладают выраженной генетической гетерогенностью (различаются по числу хромосом, что связано с неорганизованным, несинхронным, анархичным развитием). Встречают диплоидные, полиплоидные и анеуплоидные клетки, причем, чем длительнее процесс культивирования, тем сильнее различие клеток по плоидности.
В каллусных клетках достаточно часто происходят хромосомные абберации, что сказывается на биологических особенностях клеток.
Одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани является различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки.
Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель (в зависимости от скорости роста клеток), для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, переносится на свежую питательную среду (пассируется или субкультивируется). Размер транспланта (переносимого фрагмента) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно составляет от 60 до 100 мг массы ткани на 30-40 мл питательной среды.
В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенно-стями.
Большинство каллусных клеток могут расти в условиях сильного освещения или в темноте, поскольку не способны фотосинтезировать. Вместе с тем, свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза. Для обеспечения протекания данных процессов важны не только интенсивность освещенности, но и качество света. Для достижения оптимизации процесса культивирования часто используют люминесцентные лампы с интенсивностью около 1000 люкс и непрерывным «холодным белым» светом.
Для роста и развития большинства каллусных культур оптимальной является температура 26 °С. Однако индукция процессов морфогенеза требует более низких температур (18-20 °С).
Оптимальная влажность в культуральной лаборатории должна составлять 60-70 %. Большое значение для успешного культивирования каллусных клеток также имеет аэрация.
При культивировании растительных клеток и при выращивании культуры тканей применяются среды Мурасиге-Скуга, Нагата-Такебе, Хеллера, Нича-Нича, Кнудсона и другие в различных модификациях.
Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растения).
|
|
|
