 |
Культуры клеток высших растений
|
|
|
|
Можно выделить две основные тенденции применения культур клеток высших растений:
1. Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обусловливающее ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений.
2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии.
Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.
Можно назвать несколько направлений создания современных технологий на основе культивируемых клеток растений:
1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения:
- традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);
- новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу.
Кроме того, суспензионные культуры могут применяться как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ. В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений.
|
|
|
2. Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 генетически идентичных растений в год.
3. Получение безвирусных растений.
4. Использование эмбриокультуры и оплодотворения in vitro для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша при получения растений после отдаленной гибридизации.
5. Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы – используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.
6. Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые культуры в результате сомаклонального варьирования позволяют получать регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала, даже без мутагенной обработки.
7. Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.
8. Иммобилизация растительных клеток.
9. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.
10. Конструирование клеток путем введения различных клеточных органелл.
11. Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.
12. Изучение системы «хозяин – паразит» с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых).
История метода
Самые ранние работы по изолированию культур принадлежат Блоцишевскому (1876), Брауну и Моррису (1892), Боннэ и Саксу (1893). В этих исследованиях зародыши вычленялись из семени и выращивались в искусственных условиях. Первым исследователем, занявшимся установлением минимального размера экспланта, был Карл Рехингер (1893). Он выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды, без стерильных условий. Эти исследования показали, что каллус образуется при толщине среза не менее 1,5 мм.
Готлиб Габерландт (1902) научился культивировать отдельные клетки в течение некоторого времени. Но он выбрал для культивирования зеленые клетки, изолированные из палисадной паренхимы яснотки пурпурной и волосков традесканции вирджинской и медуницы мягкой, резонно рассудив, что при этом отпадет потребность в источниках углеводов. Габерландт также выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения, которая впоследствии была подтверждена экспериментально и которую еще в 1892 г. сформулировал Герман Фёхтинг на основании результатов собственных экспериментов. При этом им была убедительно показана полярность как органов, так и клеток.
|
|
|
Ряд ученых, в том числе и ученики Габерландта, последовали его примеру и также получили отрицательные результаты. Некоторые на основании этого усомнились в гипотезе тотипотентности растительных клеток. Исследования Габерландта с фотосинтезирующими клетками были неудачны, что привело к потере интереса к культивированию тканей и клеток растений. Однако они все же положили начало поиску адекватных питательных смесей и условий, необходимых для поддержания роста органов, тканей и клеток растений.
Мольяр в 1921г. культивировал сегменты корня молодых побегов редьки. Они были способны к росту в условиях культуры, но при этом не происходило формирования новых тканей.
В 1922 г. один из учеников Рехингера - Коттэ начал эксперименты с лишенными пигментов меристема-тическими тканями - изолированными кончиками корней, и добился успеха.
Практически одновременно и независимо от Коттэ Роббинс подобрал состав питательной среды, обеспечивающий в культуре рост апикальной меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало культивированию изолированных органов растений на питательных средах.
Начало длительным и удачным исследованиям по культивированию клеток и тканей растений положили работы американского исследователя Ф. Уайта и француза Р. Готре. Они показали, что изолированные органы и ткани могут расти в культуре неограниченно долгое время, если их пересаживать на свежую питательную среду. Такую же способность наблюдал Ф. Уайт для клеток опухолевого происхождения. Результаты чужих и собственных экспериментов Уайт обобщил в монографии «Культура растительных тканей». В ней он выделяет несколько периодов в истории развития метода культуры клеток, тканей и органов растений:
|
|
|
1. 1834 -1900 гг. - создание и разработка клеточной теории.
2. 1900 –1922 гг. - сформулирована идея культуры тканей.
3. 1922 – 34 гг. - безуспешные поиски методов, обеспечи-вающих длительное культивирование тканей.
4. 1934 - 39 гг. - детальная разработка техники культуры растительных тканей.
Период 1940 - 1960 гг. значительно расширил список видов, выращиваемых in vitro. В монографию Готре, вышедшую в 1959 г., включено уже 142 вида.
Были разработаны составы питательных сред, изучено значение микро- и макроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности тканей, определено влияние витаминов и стимуляторов роста. Проводились работы по выявлению значения различных натуральных растительных экстрактов для поддержания неорганизованного клеточного роста, а также для стимуляции органогенеза. Было показано значение кинетина для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого морфогенеза. Изучением этих вопросов занимались такие ученые, как Р. Хеллер, И. Нич, Ф. Скуг, Ф. Стевард, Р. Г. Бутенко. В это же время разработаны методы получения и выращивания клеточных суспензий, а также культивирования отдельной клетки, деление которой индуцируется с помощью ткани-няньки.
В 1960 - 1975 гг. положено начало методу получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов. Основоположник этого метода - Э. Коккинг. Такебе с сотрудниками определили условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют клеточные стенки, делятся и дают начало клеточным линиям, способным к морфогенезу. Были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, бактерий. В лабораториях Р. Г. Бутенко, Ю. Ю. Глебы проводились исследования поведения ядерного и цитоплазматического геномов партнеров в гибридных клеточных линиях и потомстве соматических гибридов растений - регенерантов. В этот же период были разработаны методы получения безвирусных растений из меристематических тканей. Начались эксперименты по созданию установок для глубинного культивирования клеток.
Начиная с 1976 г., разрабатывались методы электрослияния протопластов и селекции гибридных клеток, культивирования гаплоидных клеток и получения новых форм и сортов сельскохозяйственных растений. Удалось создать системы иммобилизованных клеток для получения различных химических соединений и их биотрансформации. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.
|
|
|
