Суспензионное культивирование

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами. Термин этот не является строго научным и очень точным, так как не объясняет основной особенности поведения клеток при таком выращивании.

Получено еще сравнительно мало культур клеток высших растений, по своим параметрам полностью удовлетворяющих требованиям суспензионного (глубинного) культивирования. В значительной мере это объясняется трудностями получения культуры клеток, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов.

Обычно для получения суспензионной культуры используются рыхлые обводненные каллусные ткани. Оптимальными подходами для получения суспензии являются выращивание каллусов на среде с 2,4-Д, исключение из среды ионов кальция, обработка пектиназой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре.

Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролифелирующая) часть каллусной ткани, а ее количество должно быть в 15-20 раз больше в расчете на объем питательной среды, чем при серийном культивировании на агаре (примерно 2-3 г свежей массы каллусной ткани на 60-100 мл жидкой питательной среды или примерно 0,5-2,5х105 кл/мл).

При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования, но в некоторых случаях увеличивают количество ауксинов и (или) уменьшают количество цитокининов.

Режим перемешивания и аэрации как при инициации культуры клеток, так и при дальнейших серийных субкультивированиях обеспечивается выращиванием на роллерах и качалках (круговая качалка – 10-12 об/мин). Часто интенсивность перемешивания повышается до 100-120 об/мин.

Суспезионная культура

Образование первичной суспензии растительных клеток можно считать результатом трех процессов:

1) распадение каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду;

2) отделение клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований;

3) деления и роста клеток, образовавшихся по первым двум способам, и распадения разраста-ющихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки. Последний процесс является типичным для роста стабилизировавшейся перевиваемой культуры клеток высших растений.

Первичную суспензию перед субкультивиро-ванием либо в специальном цилиндре разделяют на фракции по скорости седиментации (используют вехнюю фракцию), либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.

Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобре-тения клеточной суспензией желательных характеристик. Однако агрегированность суспензии зависит не только от характеристик начальной линии, но и от условий культиви-рования.

По степени агрегированности выделяют:

мелкоагрегированную культуру (40% - одиночные клетки, 60% - мелкие агрегаты);

среднеагрегированную культуру (40% - одиночные клетки, 40% - мелкие агрегаты, 20% - крупные агрегаты);

крупноагрегированную культуру (40% - мелкие агрегаты, 60% - крупные агрегаты агрегаты).

Для глубинного культивирования растительных клеток применяются способы, разработанные для микробиологических целей. Используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. Однако при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого является разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору. Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов.

Однако до настоящего времени наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система.

При этом признаками качественной суспензионной культуры служат способность клеток к перестройке метаболизма и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования.

Морфологические характеристики такой культуры:

высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);

морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);

отсутствие трахеидоподобных элементов.

Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:

1. Объем осажденных клеток (ООК). ООК - величина, которую составляет отношение объема осадка клеток после центрифугирования в течение 5 минут при 200 g к объему суспензии, обычно в %.

2. Число клеток. Для определения количества клеток суспензию диспергируют до одноклеточного состояния обработкой 5-10% хромовой кислотой и проводят подсчет клеток в 1 мл клеточной суспензии, нанесенной на сетку счетной камеры Фукса-Розенталя.

3. Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется под слабым вакуумом через смоченный и взвешенный нейлоновый фильтр, вложенный в воронку Бюхнера. Клетки промывают дистиллированной водой для удаления остатков питательной среды, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром. Сухая масса – определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат обычно в течение суток вместе с фильтром в термостате при 60 оС до постоянной массы.

4. Содержание белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70% этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85 оС полтора часа. Затем фильтруют и определяют белок.

5. Проводимость среды. Определяют с помощью кондуктометра. Как правило, она обратно пропорциональна свежей массе клеток.

6. Жизнеспособность клеток. Выражается отношением количества жизнеспособных клеток к общему их количеству в 1 мл суспензии. Оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью прижизненных красителей (0,01% р-р флюоресцеиндиацетата, 0,5% р-р синий Эванса). Перед использованием подбирают рН инкубационного буфера, концентрацию красителя, время инкубации, строят калибровочные кривые для смеси живых и убитых клеток.

По полученным данным строят ростовые кривые, которые имеют типичную S-образную форму.

1) (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулята не наблюдается ни по одному из критериев. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, поглощения воды и питательных веществ, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень. Длительность периода адаптации зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования.

2) экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с максимальной скоростью, максимальными величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа.

Можно выделить раннюю и позднюю экспоненциальные фазы. В течение ранней наблюдается ряд цитологических изменений: в клетках исчезает большая вакуоль, происходит увеличение объема цитоплазмы, числа рибосом и митохондрий. Активируется клеточный метаболизм. В поздней экспоненциальной фазе наблюдается замедление клеточного деления, но увеличение размера клеток.

3) фазу замедления роста, связанную с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена, и характеризующуюся несбалансированным ростом популяции по основным критериям, снижением уровня дыхания, переходом части клеток в дифференцированное состояние, увеличением доли крупных вакуолизированных клеток. Увеличивается синтез вторичных метаболитов (сердечных гликозидов, антрахинона, диосгенина).

4) стационарную фазу, характеризующуюся еще малой скоростью деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток, высокими биосинтетическими и биотрансформирующими потенциями жизнеспособных дифференциро-ванных клеток, низким уровнем дыхания и появлением чрезвычайно крупных вакуолизи-рованных клеток. К этому периоду суспензионная культура достигает максимума сухого веса. В среднем от начала культивирования до стационарной фазы проходит 21-28 суток.

5) фазу деградации клеток с удельной скоростью роста, принимающей отрицательное значение.

Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Процессы ростового цикла определяются видом растения, количеством внесенного материала и условиями культивирования (состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания).

Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются.

Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению в сосудах «мертвых» зон, в которых происходит быстрое накопление и деградация клеток.

На культуры некоторых типов клеток отрицательное влияние может оказывать механический стресс при выращивании в ферментере с турбинными мешалками при скоростях перемешивания свыше 100 об/мин. Для таких культур целесообразнее использовать мягкое перемешивание и аэрацию пневматическим способом потоком сжатого стерильного воздуха, подаваемого в ферментер. К сожалению, и этот способ имеет свой недостаток, потому что в культуральной среде возникает избыток воздуха, приводящий к кислородному голоданию, а от концентрации кислорода в среде зависят рост и вторичный метаболизм клеток. Однако необходимо помнить, что высокая степень аэрации также может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма.

Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, со провождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии клеток друг к другу и к поверхностям культурального сосуда. В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками продуктов метаболизма. При этом часть клеток скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели.

Клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время генерации (интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями) растительной клетки в 60—100 раз превосходит время генерации микробной клетки. Пул пролиферирующих клеток не превышает 50—60%, многие клетки быстро прекращают деление и переходят в фазу покоя.

Суспензионные культуры наиболее часто используют для промышленного получения вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными клетками, применяются в медицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин), пептиды (ингибиторы фитовирусов).

Культивирование отдельных

(одиночных) клеток

Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Обычно в такие клетки вводят маркерные гены, которые позволяют осуществлять селекцию.

Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания.

Работа с изолированными одиночными клетками складывается из двух этапов:

1) изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани;

2) создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки.

На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани.

Этого возможно достичь разными путями:

1. Отдельные клетки можно получать из ткани целого растения путем ее мацерации. Для получения отдельных мацерированных клеток используются специальные мацерирующие ферментные препараты, содержащие пектолитические ферменты, поливинилпирролидон, сульфат калия, сорбит (маннит), 2-N-морфолино-этансульфоновую кислоту. Данная процедура производится в условиях строгой стерильности.

Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке. Однако процесс мацерации может привести к утрате способности отдельных клеток к последующим делениям.

2. Удобнее получать отдельные клетки из суспензионных культур с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра или путем последовательных разбавлений. В этом случае суспензии готовятся разными способами: 1) либо 1-2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток, 2) либо суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся диаметром пор.

Для последовательных разведений используют платы для микротитрований, что позволяет микроскопически контролировать клеточный состав при последовательных разведениях.

Получение одиночных клеток на основе суспензионных культур связано с меньшим риском повреждения по сравнению с выделением непосредственно из тканей растения.

3. Отдельные клетки могут быть получены из рыхлых каллусов при помощи микроманипуляторов.

4. Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку.

При первых же попытках культивирования отдельных клеток стало ясно, что они ведут себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды.

Возникла важная научная проблема: как заставить делиться клетки, изолированные от влияния других клеток популяции или тканей.

Было предложено несколько вариантов культивирования отдельных клеток.

Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбрандту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки».

При этом клетку изолируют из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра, помещенный за 2-3 дня до изолирования на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. В качестве «няньки» можно также использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В любом случае каллус должен находиться в фазе активного роста. Только тогда клетки способны расти и делиться.

По мере старения каллуса-няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0,5-1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара.

Метод «ткани-няньки»

Другой вариант культивирования одиночных клеток на основе метаболитов делящихся клеток – методкондиционирования среды. В этом случае используют культуральную жидкость длительно выращиваемой суспензионной культуры. При этом клеточную суспензию для удаления клеток фильтруют через бактериальный фильтр, после чего фильтрат (среду с метаболитами) добавляют в среду для культивирования одиночных клеток.

Можно также использовать метод «кормящего слоя». Для этого в качестве кормящего одиночные клетки слоя берут суспензию клеток того же вида, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла.

Рис. Использование «кормящего слоя» (суспензионная культура) при выращивании колоний из одиночных клеток: 1 - колба, 2 - колония, возникшая из отдельной клетки, 3 - фильтровальная бумага, 4 - металлическая сетка, 5 - суспензия клеток «кормящего слоя», 6 - подложка (пенополиуретан), 7 - питательная среда.

Метод плейтинга был разработан для массового культивирования отдельных изолированных клеток. В 1959 г. Бергман предложил фильтровать суспензионную культуру (в его экспериментах это были табак и фасоль) стерильно через один слой батиста (ячейки 0,3х0,1 мм). В результате получали суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток. Эту суспензию смешивали с питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии (среда содержала 0,6% агара). Смесь разливали тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла наблюдать за их поведением под микроскопом.

Метод микрокультуры (микрокапель) базируется на использовании очень малых объемов очень богатой питательной среды, например, среды Као-Михайлюк. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл). Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается низким. Метод предложил академик Ю.Ю. Глеба. В микрокапле удобно наблюдать за получением и делением клеток при соматической гибридизации.

Метод микрокамеры был разработан Джонсом в 1960 г., и может быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной среды для культивирования отдельной клетки.

Метод включает следующие процедуры:
на предметное стекло с помощью жидкого парафина на небольшом расстоянии наклеивают покровные стекла;
между которыми наносят квадрат из жидкого парафина; в камеру из парафина помещают каплю питательной среды с отдельной клеткой; сверху камеру накрывают еще одним покровным стеклом; за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом.

Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдебрандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения.

Сложности культивирования отдельных клеток способствовали возникновению гипотезы о «факторе кондиционирования». Так было названо вещество или вещества, стимулирующие деление отдельных клеток. По-видимому, «фактор кондиционирования» вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, или же уменьшая объем среды, в котором выращивается клетка, можно заставить ее делиться.

Было выяснено, что фактор кондиционирования имеет химическую природу, термолабилен, водорастворим, низкомолекулярен, видонеспецифичен, не заменяет известные фитогормоны. Однако, несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки, и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не выяснен.

Культуры животных клеток

Идея о том, что клетки тканей животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, возникла на базе концепции, принадлежащей К. Бернару.

Чуть позже, в 1885 г., Ру показал возможность сохранения вне организма живых тканей на практике. Он в течение нескольких дней поддерживал в жизнеспособном состоянии нервную пластинку куриного эмбриона в теплом солевом (физиологическом) растворе. Позднее, в 1897 г., Леб поддерживал в жизнеспособном состоянии клетки крови и соединительной ткани в пробирках с сывороткой и плазмой крови. Льюнгрен (1898) показал возможность поддержания эксплантатов кожи человека в жизнеспособном состоянии в кислой среде с сохранением способности к реимплантации. Джолли (1903) наблюдал деление клетки в висячей капле, содержащей лейкоциты саламандры, а Биб и Эвинг (1906) подтвердили это в экспериментах с лимфосаркомной тканью собаки.

Продолжая работы Ру, Росс Гаррисон усовершенствовал методику «висячей капли». Он использовал небольшие кусочки ткани, отторгнутые от медуллярной пластинки эмбриона лягушки и внедренные в ее лимфатический тромб (сгусток лимфы), и выдерживал их в виде капли на нижней стороне покровного стекла, расположенного поверх лунки в предметном стекле. В 1907 г. ему удалось наблюдать с помощью такой «камеры» рост нервных клеток в течение нескольких недель; он установил, что скорость роста этих клеток составляет 20 мкм за 25 мин. Эксперименты Гаррисона были направлены на получение ответов на вопросы, относящиеся к физиологии нервных клеток лягушки, однако воспроизводимая методика, которой он предложил, была применена Берроузом для других клеток тканей теплокровных животных. Этот исследователь в 1910 г. вместо лимфатического тромба использовал сгусток плазмы курицы.

В 1913 г. Алексис Каррель применил плазму крови, обогащенную эмбриональным экстрактом. Примененная методика обеспечивала значительно большую вероятность успеха, чем та, которую использовала Рид (1908), пытавшиеся выращивать клетки костного мозга морской свинки на среде определенного состава. Инкубация клеток сердца куриного эмбриона была начала 17 января 1913 г. Пересев клеток продолжил Эблинг, работая с ними 34 года. Поскольку Каррель был хирургом, весьма сведущим в вопросах асептики, он смог внести существенный вклад в культивирование клеток животных in vitro.

В ходе дальнейших работ был внесен ряд поправок в рецептуру среды культивирования. В частности, Тирод модифицировал раствор Рингера и в дополнение к куриной сыворотке и эмбриональному экстракту стал использовать коагулят фибрина. В этот же период был разработан очень существенный подход в технике работы с клетками – трипсинизация – для высвобождения клеток из тканевой матрицы. Однако эта методика не находила признания до тех пор, пока в 1937 г. Симмс и Стидлман не использовали ее для пассирования клеток. Эта методика дает возможность успешно применять в культурах индивидуальные клетки, а не ткани.

Впервые клоны клеток в культуре из одиночной клетки были получены Эрлом с сотрудниками в 1948 г.

Первые суспензионные культуры клеток животных, полученные в 1953 г. Оуенсом и сотрудниками, основывались на клетках злокачественных тканей. Это – клетки HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека. Перевиваемая линия клеток карциномы шейки матки была выделена еще в 1952 г. Джеем с сотрудниками и используется в настоящее время во многих лабораториях мира.

Игл (1955) систематически исследовал пищевые потребности клеток человека и мыши.

До тех пор, пока в 1961 г. Хейфлик и Мурхед не выделили линию диплоидных клеток человека (НDС) WI-38, считалось, что один раз установившаяся клеточная линия имеет неограниченное время жизни. Относительно линии WI-38 было показано, что период ее существования в культуре ограничивается приблизительно 50 генерациями. Перед отмиранием популяции для клеток этой линии характерен феномен старения. Однако при отмирании эти клетки оставались диплоидными и не имели признаков злокачественных изменений.

Предел, или лимит, Хейфлика – граница количества делений соматических клеток. Эта граница была найдена в культурах всех полностью дифференцированных клеток человека и других животных. Максимальное число делений различно в зависимости от типа клеток и еще сильнее различается в зависимости от организма. Для большинства человеческих клеток предел Хейфлика составляет 52 деления.

Последующий этап в истории культивирования диплоидных клеток человека связан с установлением факта, что они являются генетически стабильными и свободными от всех известных латентных и онкогенных вирусов. Поэтому линии диплоидных клеток человека разрешено применять для получения продуктов, предназначаемых для людей. Эта догма остается действующей и в настоящее время, хотя дальнейшие исследования отчетливо показали присутствие в клетках, выделенных из нормальных тканей, потенциальных онкогенов, идентичных тем, которые найдены в таких известных онкогенных вирусах, как вирус саркомы Рауса и вирус саркомы Молони.

В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены в культуру и, тем самым, служить средством и объектом во многих исследованиях. Благодаря культивированию клеток возможности исследования и диагностики расширяются почти беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но и изменений в поведении клеток, их реакции на различные агенты, в том числе и на лекарственные воздействия.

Наиболее часто культивируются следующие элементы:

соединительной ткани – фибробласты;

скелетной – кость и хрящи;

мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы;

эпителиальной – печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа;

нервной – глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способности к пролиферации);

эндокринной системы – гипофиз, надпочечники, клетки островков Лангерганса;

различные типы опухолевых клеток.

 

Гепатоциты бабуина

Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Широкое использование фибробластов обусловлено не только легкостью их культивирования, но и тем, что соединительная ткань, главным клеточным элементом которой они являются, составляет значительную часть массы тела. Фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные клеткам в организме, а также онтогенетические и индивидуально-генотипические свойства организма-донора. Не существует другого такого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма. Изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму при создании соответствующих условий.

Гринбергом в 1978 г. была доказана возможность экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo.

⇐ Предыдущая78910111213141516Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: