 |
Стандартные среды для культур животных клеток
|
|
|
|
Среды Игла MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Чаще используется МЕМ. Она содержит минеральные вещества, аминокислоты (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа раствор Эрла.
Среда Дульбекко DME или DMEM (двойная модификация среды Игла). Используется при культивировании клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. Является основой для бессывороточных сред. Содержит двойную концентрацию аминокислот, глицин, серин, пируват, железо. При использовании этой среды необходим инкубатор с 10% концентрацией СО2.
Среда Искова IMDM - модификация среда Дульбекко. Добавлены незаменимые аминокислоты, биотин, витамин В12, селенит натрия. В среду введен HEPES и уменьшены концентрации NaCl и NaHCO3. Среда бессывороточная, обычно используется для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток.
Среда МакКоя 5А и серия сред RPMI. Среда МакКоя 5А разработана в 1958 году для поддержания клонального роста клеток карциносаркомы Уолкера 256 в присутствии сыворотки, а затем уже других первичных культур и различных клеточных линий. Обычно производится в модификации Ивката и Грейса (RPMI) и предназначена для культивирования лейкоцитов в присутствии сыворотки, часто применяется и для культивирования гибридом. Концентрация СО2 в атмосфере при культивировании 5%.
Среда 199 разработана в 1950 году для культивирования фрагментов сердца из эмбриона цыпленка. Для среды характерны широкий спектр питательных веществ и невысокая их концентрация. Используется без добавок, как поддерживающая для первичных клеток, а с сывороткой как ростовая среда для быстро размножающихся клеток.
|
|
|
Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если они не трансформированы). Для оптимизации роста клеток обычно добавляют 5-20% фетальной (эмбриональной) сыворотки.
Сыворотка представляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способных как вызывать, так и тормозить рост клеток.
К главным функциям сыворотки относятся:
обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции;
обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток;
обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д.
Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторами роста.
Большинство ростовых факторов присутствуют в сыворотке в неопределяемых следовых количествах. Некоторые из этих факторов специфичны для клеток на определенной стадии дифференцировки, действие других не ограничено каким-либо одним типом клеток. Один и тот же тип клеток может быть стимулирован различными ростовыми факторами. Например, фибробласты размножаются в ответ на фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, фактор роста, синтезируемый тромбоцитами и соматомедины. Все эти вещества являются митогенами (стимулируют митоз).
Другим важным фактором роста практически для всех типов клеток является гормон инсулин. Из других гормонов наиболее часто применяются глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон), стероиды (эстрадиол, тестостерон, прогестерон) и гормоны щитовидной железы (трииодтиронин).
Гормоны стимулируют или подавляют рост в зависимости от типа клеток и их плотности. Глюкокортикоиды, например, влияют на пролиферацию клеток, изменяя их чувствительность к факторам роста.
|
|
|
Для переноса низкомолекулярных факторов (витаминов, аминокислот, липидов и других) необходимы транспортные белки. В этой роли выступает альбумин. Транспорт железа обеспечивает трансферрин, и поверхность большинства культивируемых клеток содержит рецепторы для этого белка.
К факторам прикрепления и распластывания клеток относятся содержащиеся в сыворотке коллаген и фибронектин, ά-глобулиновая сывороточная фракция фетуин. Более специализированы хондронектин (адгезия хондроцитов) и ламинин (адгезия эпителиальных клеток).
Культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает и ряд недостатков:
для большинства тканей сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани. Например, сыворотка вызывает рост фибробластов, но тормозит рост эпидермальных кератиноцитов;
сыворотка может быть цитотоксичной, так как содержит полиаминоксидазу, действующую на полиамины (спермин, спермидин), являющиеся продуктами секреции быстро пролиферирующих клеток;
значительная вариабельность состава сывороток разных партий;
сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических ростовых факторов, что вызывает необходимость добавления их к культурам клеток.
В настоящее время предпринимаются попытки создания и применения бессывороточных питательных сред, в которых сыворотка заменяется смесью гормонов (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды и др.) и ростовых факторов. Эти среды необходимы, если требуется избежать присутствия чужеродного белка и из-за высокой стоимости эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Бессывороточные среды имеют определенные преимущества: улучшение воспроизводимости результатов вследствие большей стабильности состава среды; снижение риска заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмами; облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; отсутствие цитотоксичности сыворотки. Однако в настоящее время бессывороточные среды имеют существенные недостатки: добавление в дешевую среду гормонов и факторов роста делает ее такой же дорогой, как среда с сывороткой. Кроме того, чаще всего бессывороточные среды пригодны для ограниченного числа клеток, т.е. узко специализированы.
|
|
|
Следовательно, оптимизация состава питательных сред для культур животных клеток развивается в двух направлениях – разработка сред, требующих внесения природных добавок (сыворотки, эмбриональные экстракты и др.), и создание сред химически определенного состава.
В настоящее время наиболее широко применяются среды, содержащие источники энергии (углеводы) и азота; незаменимые аминокислоты; витамины; неорганические соли – источники макро- и микроэлементов, включая селенит; нуклеозиды; жиры и жирорастворимые компоненты; гормоны (инсулин, трансферрин, глюкокортикоиды, эстроген, андроген, тироксин, трииодтиронин); ростовые факторы (фактор роста, синтезируемый тромбоцитами, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса), а также сыворотку (до 20%) и в ряде случаев некоторые другие добавки (бактопептон, триптозофосфат и т. п.).
Одна из проблем, возникающих при попытках получить культуры одиночных клеток или культуры клеток с низкой плотностью (100 кл\мл), заключается в том, что в этих условиях клетки погибают или растут очень медленно. В результате подробных исследований была разработана концепция “кондиционированной среды”. Кондиционированная среда – это среда, в которой концентрация метаболитов находится на таком уровне, что наступает равновесие между выходом метаболитов из клеток в среду и обратным захватом этих метаболитов клетками.
Культивирование клеток и тканей беспозвоночных
Интерес к клеточным культурам беспозвоночных связан с разнообразием и оригинальностью роста и метаморфоза.
С другой стороны, при широкомасштабном промышленном получении энтомопатогенных препаратов целесообразнее для получения больших количеств вирусного материала использовать живые клетки насекомых-хозяев, чем их личиночные стадии.
Первые попытки культивирования клеток насекомых были предприняты в начале 20-го века. Однако среди ученых длительное время было распространено мнение, что выращивание клеток беспозвоночных в культуре не имеет практического значения. По этой причине исследования в области культуры клеток насекомых велись недостаточно активно.
|
|
|
Прогресс в получении клеточных линий насекомых был последовательно обеспечен трудами В. Трагера в конце 30-х годов текущего столетия, С. Вьятта (1956), Т. Д. С. Грейса (1962).
Интенсивные исследования проблемы начались именно в 60-х гг., когда Грейс, модифицировав среду Вьятта, получил первые четыре стабильные перевиваемые линии из тканей яичников эвкалиптового шелкопряда.
В 1976 г. уже насчитывалось более 120 перевиваемых линий клеток насекомых, а к 1985 г. их количество превысило 200.
Для получения культуры клеток и тканей беспозвоночных используют эмбрионы, имагинальные диски и органы насекомых, гомоциты, яичники, жировые тела.
Лучшие источники для получения культивируемых клеток - личинки и куколки насекомых.
Методика получения первичных культур клеток насекомых достаточно отработана. Она включает следующие этапы: стерилизация поверхности насекомых и подлежащих культивированию тканей; диссоциация клеток; пересадка их на питательную среду.
Срок жизни первичных клеточных культур ограничен. Через определенное время культура стареет, что проявляется в грануляции цитоплазмы, сморщивании и округлении клеток, потери связей между клетками и твердым субстратом.
Клеточные культуры насекомых имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками млекопитающих как объект биотехнологических производств: возможность культивирования при комнатной температуре, дешевизна культуральных сред, отсутствие необходимости в CO2 инкубаторах, высокая плотность в культуре и др.
Среды для культивирования клеток и тканей насекомых сильно варьируют по составу. При составлении питательных сред часто руководствуются данными по составу гемолимфы, различающейся у разных видов насекомых. В настоящее время предложено более 50 вариантов питательных сред для культивирования клеток беспозвоночных. Все эти среды отличаются от сред для клеток млекопитающих наличием органических кислот, повышенным содержанием аминокислот и более высоким осмотическим давлением. Ни одна из этих сред ни пригодна для поддержания культур клеток всех видов беспозвоночных, т.е. не является универсальной.
Наиболее часто используют среды Митсухаси и Марамороша (среда ММ), Шилда и Санга (среда М3), Шнейдера; Эхальера и Оганесяна (среда D-22), IPL-41 и другие. Фирма Sigma (США) выпускает указанные среды в сухом виде.
Культуры клеток беспозвоночных животных также представляют огромный интерес для изучения молекулярных механизмов взаимодействия хозяин-паразит, роли мобильных генетических элементов в адаптации беспозвоночных к стрессовым ситуациям окружающей среды, регуляции действия генов в клетках высших организмов и клеточных механизмов дифференцировки и т.д.
|
|
|
