 |
Состав и приготовление экстрагирующего буфера ОВ
|
|
|
|
Компонент
| Деионизованная вода, мл | 8,6 | 17,3 | 25,8 | 43,5 | 69,6 |
| 1 М трис-На рН 8, мл | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,5 | 0,8 |
| 5 М №С1, мл | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 1,0 | 1,6 |
| 0,5 М ЭДТА-№ рН 8, мл | 0,5 | 1,0 | 1,5 | 2,5 | |
| 10%-ный ДДС-№, мл | 0,5 | 1,0 | 1,5 | 2,5 | |
| Раствор протеиназы К, мкл | |||||
| Раствор РНКазы А, мкл |
2. Полученный раствор перемешивают и используют в течение
1 ч.
Выделение и очистка ДНК. 1. Навеску тканей животных (100 мг) помещают в фарфоровую ступку, заливают жидким азотом и очень быстро растирают (не допуская оттаивания) до состояния мелкого порошка. Полностью переносят порошок в
центрифужную пробирку объемом до 15 мл, добавляют 3 мл свежеприготовленного буфера БВ, пробирку закрывают, содержимое перемешивают, несколько раз перевернув пробирку.
2. Пробирку инкубируют на водяной бане при 56 "С в течение 2—3 ч (или при 65 "С в течение 1 ч), периодически перемешивая содержимое.
3. По окончании инкубации в пробирку добавляют 3 мл смеси хлороформ + зоамиловый спирт и эмульгируют содержимое, переворачивая пробирку.
4. Пробирку центрифугируют 5 мин при 10 000 #. Верхнюю водную фазу полностью отбирают в чистую пробирку, не захватывая нижней фазы и твердой интерфазы. Если на поверхности водной фазы видна пленка жира (капли, хлопья), необходимо повторить пп. 3, 4.
5. В пробирку с водной фазой (раствор ДНК) добавляют 3 мл фенола, насыщенного ТЕ-буфером, эмульгируют содержимое, переворачивая пробирку. Не затягивать эту стадию, так как возможно разрушение ДНК!
6. Пробирку центрифугируют 2 мин при 10 000 §. Верхнюю водную фазу полностью отбирают в чистую пробирку, не захватывая нижней фазы и твердой интерфазы.
7. В пробирку с водной фазой добавляют 1,5 мл фенола и 1,5 мл смеси хлороформ + изоамиловый спирт и эмульгируют содержимое, переворачивая пробирку.
|
|
|
8. Пробирку центрифугируют 2 мин при 10 000 §. Верхнюю водную фазу полностью отбирают в чистую пробирку.
9.В пробирку с водной фазой добавляют 3 мл смеси хлороформ ++ изоамиловый спирт, хорошо эмульгируют содержимое, переворачивая пробирку в течение 1—2 мин для полной экстракции остатков фенола.
10. Пробирку центрифугируют 2 мин при 10 000 %.
11. Повторяют пп. 8—10. Верхнюю водную фазу полностью отбирают в чистую пробирку.
12. В пробирку с водной фазой добавляют 750 мкл 10 М раствора ацетата аммония, аккуратно перемешивают, затем сразу добавляют 6 мл 96%-ного этанола и снова аккуратно перемешивают, осторожно наклоняя и переворачивая пробирку. При этом из прозрачного раствора выпадает ДНК в виде осадка из белых хлопьев,так называемая «медуза». Если этого не происходит, пробирку оставляют при —18 "С на 1—3 ч, можно на ночь, но не более.
13. Образец центрифугируют при 10 000 § в течение 2—5 мин, в
зависимости от количества выделенной ДНК.
14. Супернатант полностью удаляют, осадок промывают, ополоснув небольшим количеством (100 мкл) сначала 70%-ного, а затем дважды 96%-ного этанола.
15. Осадок высушивают в открытых пробирках при 56 "С в течение 5—7 мин.
16. К высушенному осадку добавляют 150 мкл ТЕ-буфера и оставляют растворяться в течение ночи при температуре 2—8 °С.
Хранить полученный раствор ДНК лучше при —18 °С, не допуская
частого размораживания, или более краткое время при 2—8 "С!
Контрольные вопросы. 1. Какой детергент используют для экстракции ДНК,
каково его назначение? 2. Почему рН экстрагирующего буфера должен быть равен
8? 3. Почему пробирку с осадком ДНК необходимо переворачивать осторожно?
4. Для чего используют фенол и хлороформ?
Задания. 1. Получить препарат ДНК из ткани животного. 2. Составить описание выделения ДНК из 2 г животной ткани для препаративных целей (например, гибридизации).
|
|
|
Занятие № 2
СТАВ-ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ РАСТЕНИЙ
Цель занятия. Освоить классический метод выделения и очистки ДНК из растительных объектов с помощью СТАВ.
Оборудование и материалы. 1. Термостат (водяная баня). 2. Центрифуга до
5000 § для пробирок вместимостью до 15 мл. 3. Микроцентрифуга до 10 000 # для
микропробирок вместимостью до 1,5 мл. 4. Термостат твердотельный для микро-пробирок вместимостью до 1,5 мл. 5. Фарфоровые ступки с пестиками. 6. Весы лабораторные на 0,01—10 г. 7. Пробирки центрифужные вместимостью 15 мл с завинчивающейся крышкой. 8. Микропробирки вместимостью 1,5 мл. 9. Образец свежих растительных тканей (листья, молодые побеги, кожура плодов). 10. Жидкий азот в сосуде Дьюара. 11. 1 М трис-НС1 буферный раствор рН 8*. 12.5 М раствор №С1*. 13. 0,5 М раствор ЭДТА-№ рН 8*. 14. р-меркаптоэтанол*.15.СТАВ(смесь изомеров алкилтриметиламмоний бромида). 16. ТЕ-буфер (10 мМ трис-
НС1, 1 мМ ЭДТА-№ рН 8)*. 17. Деионизованная вода. 18. Смесь хлороформ +
+ изоамиловый спирт (24: 1), насыщенная ТЕ-буфером, рН 8**. 19. Фенол пере-
гнанный, насыщенный ТЕ-буфером рН 8**. 20. Раствор РНКазыА (10 мг/мл,
готовить на стерильной деионизованной воде, после растворения препарата
РНКазыА раствор выдержать 15 мин на кипящей водяной бане для инактивации
ДНКаз)*. 21. Изопропанол. 22. 3 М раствор ацетата натрия. 23. 96%-ный этанол.
24. 70%-ный этанол.
- * Хранить при температуре 2—8 °С.
** Хранить в темноте и при температуре 2—8 "С.
Ход работы. Приготовление экстрагирующего
буфера (СТАВ-б у ф е р).
Внимание! Использовать только свежеприготовленный раствор.
Смешивают отдельные компоненты СТАВ-буфера в герметично закрывающейся посуде (например, пластиковом флаконе с завинчивающейся крышкой) в соответствии с требуемым объемом конечного раствора, исходя из указанных пропорций (можно рас-
считать самостоятельно) (табл. 3).
| 3. Состав и | приготовление | СТАВ-буфера | |
| Компонент | Конечный объем раствора, мл | ||
| 20 30 50 |
| Деионизованная вода, мл | 7,3 | 14,6 | 21,9 | 36,5 | 58,4 |
| 1 М трис-ЯС\ рН 8, мл | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 5,0 | 8,0 |
| 5 М №С1, мл | 1,4 | 2,8 | 4,2 | 7,0 | 11,2 |
| 0,5 М ЭДТА-№ рН 8, мл | 0,20 | 0,40 | 0,60 | 1,0 | 1,6 |
| Р-Меркаптоэтанол, мл | 0,10 | 0,20 | 0,30 | 0,50 | 0,8 |
| СТАВ, г | 0,10 | 0,20 | 0,30 | 0,50 | 0,80 |
Раствор перемешивают, нагревают смесь до 65 "С на водяной
бане до полного растворения СТАВ, используют готовый раствор
в течение 1 ч (до употребления не давать раствору остыть!).
|
|
|
Выделение ДНК. 1. Помещают в фарфоровую ступку 2 г
свежей растительной ткани (лучше листья), заливают жидким азотом и очень быстро растирают (не допуская оттаивания) до состояния мелкого порошка.
2. Полностью переносят порошок в центрифужную пробирку вместимостью до 15 мл, добавляют 9 мл свежеприготовленного и нагретого до 65 °С СТАВ-буфера, пробирку закрывают, содержимое перемешивают, несколько раз перевернув пробирку.
3. Пробирку инкубируют 60 мин при 65 °С на водяной бане, каждые 10—15 мин содержимое перемешивают, несколько раз перевернув пробирку.
4. Охлаждают пробирку 4—5 мин при комнатной температуре.
5. К гомогенату добавляют 4,5 мл смеси хлороформ + изоамиловый спирт, пробирку закрывают, содержимое перемешивают,несколько раз перевернув пробирку, до образования стойкой белесой взвеси.
6. Пробирку ценрифугируют 20 мин при 5000 # (скорость вращения рассчитывают в соответствии с диаметром ротора).
7. Верхнюю водную фазу полностью отбирают в чистую центрифужную пробирку вместимостью до 15 мл.
8. Добавляют в пробирку 10 мкл раствора РНКазы А, инкубируют 40 мин при 37 "С.
9. По окончании инкубации в пробирку добавляют 6 мл изопропанола (предварительно охлажденного до —18 °С), содержимое очень аккуратно перемешивают, плавно переворачивая закрытую пробирку несколько раз до полного объединения фаз. В процессе перемешивания должен появиться заметный осадок ДНК в виде рыхлого комка — «медузы». Если этого не происходит, оставляют пробирку при -18 "С на 1—3 ч, можно на ночь (16—18 ч), но не
более.
10. Осадок ДНК извлекают из пробирки, намотав его на стеклянный капилляр, и переносят в чистую микропробирку вместимостью 1,5 мл. Если намотать осадок на капилляр не удается,
центрифугируют его 1 мин при 5000 §, супернатант полностью удаляют.
11. Осадок ДНК сушат на воздухе 7—10 мин, как можно более полно удалив перед этим с осадка всю жидкость.
|
|
|
12. Добавляют к осадку 500 мкл стерильной деионизованной воды и оставляют растворяться в течение ночи при температуре
-80С
Очистка ДНК фенолом и хлороформом. 1. К раствору ДНК добавляют 500 мкл фенола, насыщенного ТЕ-буфером (для этого раствор ДНК предварительно переносят в микро-пробирку вместимостью 1,5 мл, если это не сделано ранее). Про-бирку несколько раз переворачивают до образования стойкой
взвеси, а затем выдерживают в таком состоянии еще 1 мин.
2. Микропробирку центрифугируют 5 мин при 10 000 #, супернатант полностью переносят в чистую микропробирку, не задевая нижней фенольной фазы и твердой интерфазы.
3. Добавляют к раствору 250 мкл фенола и 250 мкл смеси хлороформ + изоамиловый спирт. Пробирку несколько раз переворачивают до образования стойкой взвеси, а затем выдерживают в таком состоянии еще 1 мин.
9. Микропробирку центрифугируют 5 мин при 10 000 #, супернатант полностью переносят в чистую микропробирку, не задевая нижней фенольной фазы и твердой интерфазы.
5. Добавляют к раствору 500 мкл смеси хлороформ + изоамиловый спирт. Пробирку несколько раз переворачивают до образования стойкой взвеси, а затем выдерживают в таком состоянии еще 1 мин.
6. Микропробирку центрифугируют 5 мин при 10 000 #, супернатант полностью переносят в чистую микропробирку, не задевая нижней фенольной фазы и твердой интерфазы.
7. Добавляют в пробирку 50 мкл 3 М раствора ацетата натрия,аккуратно перемешивают и сразу добавляют 1 мл 96%-ного этанола. Аккуратно перемешивают содержимое, плавно переворачивая пробирку несколько раз до полного объединения фаз. В процессе перемешивания должна появиться «медуза». Если этого не происходит, оставляют пробирку при -18 °С на 1—3 ч, можно на ночь,но не более.
8. Микропробирку центрифугируют при 10 000 § в течение 1—3 мин, в зависимости от компактности «медузы» (чем она плотнее, тем меньше).
9. Супернатант полностью удаляют, осадок промывают, ополоснув небольшим количеством (100 мкл) сначала 70%-ного, а затем дважды 96%-ного этанола.
10. Сушат осадок в открытых пробирках при 56 °С в течение 5—7 мин.
11. Добавляют к осадку 300 мкл ТЕ-буфера и оставляют растворяться в течение ночи при температуре 2—8 "С.
Хранить полученный раствор ДНК лучше при -18 "С, не допуская
частого размораживания, или в противном случае при 2—8 "С.
Контрольные вопросы. 1. Чем отличаются процессы экстракции ДНК из расти-
тельных и животных тканей? 2. Почему для экстракции растительной ДНК требу-
ется осаждение (а иногда и многократное осаждение) из раствора? В чем смысл
этой процедуры? 3. Почему недопустимо многократное размораживание водного
раствора ДНК в ходе хранения?
|
|
|
Задания. 1. Получить препарат растительной ДНК. 2. Составить
описание выделения ДНК из 100 мг растительной ткани для аналитических целей (например, ПЦР).
Занятие № 3
ВЫДЕЛЕНИЕ ТОТАЛЬНОЙ РНК ПО ШЕРРЕРУ
Этот классический метод применяют для выделения тотальной
РНК из любых животных тканей, а также из клеток бактерий, например кишечной палочки (Еscherichia coli). Принцип метода заключается в том, что при обработке ткани водонасыщенным фенолом, содержащим 0,5%-ный раствор додецилсульфата натрия, в
водную фазу при 4 °С переходят и ДНК, и РНК. Однако при нагревании до 50—60 "С ДНК остается в связанном состоянии и в водную фазу переходит только РНК.
Цель занятия. Ознакомиться с классическим методом выделения тотальной РНК по Шерреру.
Оборудование и материалы. 1. Центрифуга рефрижераторная до 4500 #. 2. Гомогенизатор. 3. Термостат (водяная баня).4.Шприц стеклянный вместимостью 50 мл. 5. Воронка Бюхнера диаметром 65 мм. 6. Ступка фарфоровая. 7. Колба коническая вместимостью 200 мл. 8. 2%-ный раствор ИаОН. 9. 0,2%-ный раствор
додецилсульфата натрия. 10. 96%-ный этанол. 11. 0,5 н. хлорная кислота. 12. Фенол свежеперегнанный водонасыщенный. 13. Поливинилсульфат. 14. 0,01 М ацетатный буфер рН 5,2 (смешивают 10,5 мл 0,02 М раствора уксусной кислоты и 39,5 мл 0,02 М раствора ацетата натрия и доводят объем водой до 100 мл). 15. Хлорид магния. 16. Реактив для растворения РНК: 0,05 М N301, 0,01 М ацетат натрия,
0,0001 М МёС12. 17. Жидкий азот. 18. Лед. 19. Свежая ткань животного.
Ход работы. 1. Ткань животного предварительно промывают
для инактивации поверхностных нуклеаз сначала 2%-ным водным
раствором гидроксида натрия, затем 0,2%-ным раствором ДДСЖа
и, наконец, дистиллированной водой. Эту операцию проводят на
воронке Бюхнера; на 1 г ткани берут по 50 мл указанных растворов.
2. В фарфоровую ступку помещают 1 г промытой ткани, измельчают с жидким азотом в тонкий порошок, после чего растирают в ступке с 10 мл 0,01 М ацетатного буфера (рН 5,2), содержащего 0,001 М М§С12, 0,5%-ный ДДС-Ма и 2 мкг/мл поливинилсульфата (ингибитор активных РНКаз), в течение 30 мин при повторном замораживании и оттаивании. Если нет жидкого азота, то ткань предварительно измельчают в гомогенизаторе, затем переносят в фарфоровую ступку, охлажденную льдом, и проводят растирание, как описано выше.
3. Полученную вязкую суспензию переносят в стакан, прибавляют 10 мл свежеперегнанного водонасыщенного горячего фенол(60 °С) и взбалтывают в течение 3 мин на водяной бане при 60 "С.
4. Смесь охлаждают во льду и центрифугируют при 4500 # и температуре 4 °С в течение 30 мин. В результате центрифугирования образуется три слоя: верхний водный, промежуточный, нижний фенольный.
5. Водный слой осторожно отсасывают шприцем в колбу и дважды обрабатывают водонасыщенным фенолом, предварительно Нагретым до 60 "С, проводя каждый раз быстрое охлаждение и центрифугирование при 4500 # и температуре 4 "С в течение 30 мин. После каждого центрифугирования водный слой отбирают и обрабатывают далее, а фенольный отбрасывают.
Для осаждения РНК к водному слою добавляют два объема96%-ного этанола. Осадок РНК формируется в течение нескольких часов при 0 °С.
7. Осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 4500 § и температуре 0 °С, спирт отбирают, а осадок РНК растворяют в 5 мл 0,05 М раствора хлорида натрия, содержащего 0,01 М ацетата натрия и 0,0001 М хлорида магния. Из полученного раствора РНК снова осаждают двумя объемами 96%-ного этанола. Осадок РНК выпадает за 1,5—2 ч при температуре —10 "С.
8. Осадок РНК либо хранят под спиртом, либо отделяют центрифугированием, спирт отбрасывают, а осадок снова растворяют в 5 мл раствора, содержащего хлорид натрия, ацетат натрия и хлорид магния, и хранят в холодильнике без замораживания.
Контрольные вопросы. 1. Какой принцип лежит в основе метода выделения
тотальной РНК по Шерреру? 2. Что обеспечивает инактивацию РНКаз и сохран-
ность РНК при выделении ее данным методом?
Задание. Получить препарат тотальной РНК из ткани живот-
ного.
Занятие № 4
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СООТНОШЕНИЙ _.
РИБОСОМАЛЬНЫХ И ТРАНСПОРТНЫХ РНК МЕТОДОМ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Для фракционирования тотальной РНК используют методы
ультрацентрифутирования в градиенте плотности сахарозы, коло-
ночную хроматографию и электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).
Особого внимания из перечисленных методов заслуживает метод электрофореза в ПААГ. Преимущество этого метода состоит в
том, что можно контролировать величину пор синтетического
геля и одновременно проводить анализ большого количества образцов. Для фракционирования РНК используют гель с низкой
концентрацией акрил амид а (1,8—3,5 %). Электрофорез в ПААГ с
концентрацией акриламида 2,4 % позволяет разделить суммарную
РНК на три фракции: две высокомолекулярные и одну низкомолекулярную. Наиболее прост в исполнении диск-электрофорез РНК на колонках ПААГ.
Цель занятия. Научиться фракционировать РНК и определять
содержание различных РНК.
Оборудование и материалы. 1. Спектрофотометр. 2. Микрофотометр. 3. Источник питания для электрофореза. 4. Прибор для вертикального электрофореза.
5. Термостат (водяная баня). 6. Шприц стеклянный вместимостью 50 мл. 7. Трубки стеклянные с внутренним диаметром 0,5—0,6 см. 8. Колбы мерные вместимостью 100 и 1000 мл. 9. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 10. Препарат РНК, выделенный по методу Шеррера. П. Цианогум-41 (или
акриламид и Ы,Н'-метилен-&мс-акриламид). 12. Тетраметилэтилендиамин
(ТЕМЭД). 13. 10%-ный раствор персульфата аммония. 14. 40%-ный раствор сахарозы. 15. 0,25%-ный раствор бромфенолового синего. 16. трмс-ацетатный буфер
рН 7,8 (0,12 М трис, 0,06 М ацетат натрия, 0,003 М ЭДТА-№, рН довести до 7,8
ледяной уксусной кислотой, для чего потребуется около 6 мл этого реактива).
17. 0,5 М хлорная кислота. 18. 1 М уксусная кислота. 19. 0,2%-ный раствор метиленового синего в 0,4 М ацетатном буфере.
Ход работы. Приготовление геля. Для этой цели используют цианогум-41, представляющий собой смесь 95%-ного
акриламида и 5%-ного М,М'-метилен-6мс-акриламида. Фракционирование суммарной РНК, выделенной по методу Шеррера, проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле с конентрацией акриламида 2,4 %. К 2,53 г цианогума-41 (или к 2,4 г акриламида и 0,13 г 14,№-метилен-6ш-акриламида) добавляют 33,3 мл т/> исацетатного буфера (рН 7,8), 50 мл дистиллированной воды и 0,08 мл ТЕМЭД. Смесь тщательно перемешивают, добавляют 0,8 мл 10%-ного раствора персульфата аммония, доливают воду до метки (100 мл), еще раз хорошо перемешивают и заполняют этим раствором стеклянные трубки для электрофореза с внутренним диаметром 0,5—0,6 см и длиной 7—8 см. Процесс полимеризации проводят без доступа кислорода, для чего после добавления в колонку полимеризуемой смеси наслаивают на нее буферный раствор. Перед заполнением электрофоретической камеры
трис- ацетатный буферный раствор (рН 7,8) разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:2.
Нанесение образца РНК на гель. После полной полимеризации геля на его поверхность наслаивают 0,01—0,05 мл раствора, содержащего 30—60 мкг РНК, 40%-ный раствор сахаро зы (конечная концентрация 20 %) и 0,01 мл 25%-ного водного раствора бромфенолового синего. Сахароза повышает плотность раствора РНК, вносимого в колонку, по отношению к плотности буфера, и обеспечивает надежный контакт испытуемого образца с поверхностью геля.
Концентрацию РНК в испытуемой смеси определяют следующим образом: к 0,1мл раствора, содержащего РНК, добавляют 5 мл 0,5 н. раствора хлорной кислоты и проводят гидролиз на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем измеряют оптическую плотность гидролизата на спектрофотометре при 270 и
290 нм. Концентрацию РНК, мкг/мл, определяют по формуле
(А270 - А290) ■ \0,5
'мкг/мл 0,19
где А — оптическая плотность при соответствующей длине волны;
10,5 — коэфициент пересчета, выведенный на основании теоретического расчета содержания фосфора в РНК; 0,19 - коэффициент, соответствующий содержанию 1 мкг
РНКв 1 л раствора, полученный при замере на спектрофотометре содержания фосфора нуклеиновых кислот указанной концентрации.
Проведение электрофореза и обнаружение РНК Электрофорез проводят при силе тока 5 мА на колонку и температуре 0—3 °С в течение 60 мин. После его окончания гели извлекают из трубок, фиксируют и окрашивают. Фиксацию проводят 1 М раствором уксусной кислоты в течение 15 мин, а окрашивание — 0,2%-ным раствором метиленового синего в 0,4 М ацетатном буфере (рН 4,7) в течение 4 ч. Краситель с той части колонки, которая не содержала нуклеиновых кислот, многократно отмывают водой в течение 8—12 ч. Полученные электрофореграммы фотографируют и денситометрируют (рис. 3). Площадь пика, соответствующую каждой
фракции РНК, рассчитывают по формуле
где А — содержание фракции РНК, условные единицы; \% к — десятичный логарифм высоты пика; а — основание пика, мм.
Суммируя величины А, полученные для всех фракций, находят общее содержание РНК в условных единицах и рассчитывают далее процентное содержание каждой фракции РНК. Зная количество РНК в образце, нанесенном на колонку, вычисляют содержание каждой фракции РНК (табл. 4).
| Номер фракции |
|
|
|
