Количественное определение белка

ПО МЕТОДУ ЛОУРИ

Количественное определение белка осуществляют наиболее распространенными колориметрическими методами. Эти методы основаны на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии белков со специфическими реагентами.Наиболее часто используют два метода количественного определения белков посредством цветных реакций: метод Лоури и метод Брэдфорд. Как и все другие методы, основаннные на цветных реакциях, они дают абсолютные данные о содержании белка, только когда калибровочный график построен по определяемому данным методом белку. Однако зачастую экспериментаторы не имеют достаточных для построения калибровочных графиков количеств чистых препаратов тех белков, которые они исследуют. Поэтому на практике калибровочные графики чаще всего строят с использованием доступных коммерческих препаратов широко распространенных в природе белков, таких как альбумины сыворотки крови млекопитающих. Тем не менее методы Лоури и Брэдфорд обладают высокой чувствительностью, достаточно просты в исполнении и широко применяются для количественного определения широкого спектра белков различного происхождения.

Метод Лоури основан на измерении интенсивности окраски раствора, в котором осуществляется цветная реакция на белок, с тирозиновым и цистеиновым радикалами аминокислотных остатков, входящих в состав полипептивной цепи белка. Эта реакция заключается в восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комплексного соединения синего цвета.Реакции восстановления способствуют комплексные соединения меди, возникающие при взаимодействии белка с щелочным раствором сульфата меди.

Следует учитывать, что котнцентрация белка, определеннная методом Лоури в грубых экстрактах белков и биологических жидкостях (крови, лимфе и др.), оказывается несколько завышенной за счет того, что реактив Фолина вступает во взаимодействие с радикалами соответствующих свободных аминокислот, присутствующих в исследуемом биологическом материале. Для того чтобы избежать завышенных результатов определения, целесообразно обработать аликвоту(1-2 мл) исследуемого раствора белка равным объемом 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и поместить пробу на 30-40 мин в холодильник. В результате такой обработки содержащиеся в растворе белки выпадают в осадок, а свободные аминокислоты остаются в растворе. Затем полученный осадок белков собирают центрифугированием (3000-4000 g,10 мин), растворяют в небольшом фиксированном объеме 0,1 М раствора NaOH и используют для определения содержания белка методом Лоури.

Цель работы. Освоить метод количественного определения белка.

Оборудование и материалы. 1.Фотоэлектроколориметр.2. Цилиндр мерный вместимостью 50 мл. 3.Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 4.Пробирки химические. 5.Раствор А: 0,1 М NaOH c 2%-ным Na₂CO₃. Раствор В: 1%-ный раствор цитрата натрия (или 3,33%-ный раствор тартрата калия или натрия) с 0,5%-ным CuSO₄х5H₂O.7.Реактив Фолина (используют коммерческие препараты с определенными титрами). 8. Бычий сывороточный альбумин (БСА) кристаллический (используется для построения калибровочного графика). 9.Исследуемый препарат белка (можно использовать белковые экстракты, полученные в ходе практической работь №15).

Ход работы. 1.Смешать 49 мл раствора А и 1 мл раствора В. 2. К 1 мл исследуемого белкого раствора, содержащего от 20 до 100 мкг белка, добавить 4 мл смеси раствора А и В.

Внимание! Следует учесть, что белковый экстракт, образуемый при выделении белков из животных и растительных тканей (см.практическую работу №15), как правило, содержит большее количество растворимых белков и для получения достоверных данных об их содержании экстракт следует предварительно разбавить 0,15 М раствором NaCI в 10-20 раз. Степень разведения затем учитывают при расчетах содержания белка.

3.Полученную смесь перемешать и оставить при комнатной температуре на 10 мин.

4. К смеси добавить 0,4 мл реактива Фолина, энергично перемешать и оставить на 30-90 мин для развития окраски. При этом желтая окраска смеси постепенно переходит в синюю.

5. Измерить оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 750 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.

6. Для определения содержания белка в исследуемом растворе построить калибровочную кривую. Для этого приготовить серию растворов бычьего сывороточного альбумина с содержанием белка от 0,2 до 2,0 мг/мл путем разведения матричного (исходного) раствора БСА концентрацией 2 мг/мл(табл.10). Для проведения реакции полученные растворы разбавить в 10 раз (в пробу вносят по 0,1 мл раствора БСА и 0,9 мл дистиллированной воды) и с каждым из них провести реакцию Лоури не менее 3 раз (см.пп.2-5). По установленным значениям ΔА₇₅₀ построить калибровочную кривую (рис.24).

7. С использованием калибровочной кривой определить содержание белка в исследуемом растворе. Затем пересчитать содержание белка на 1 мл исследуемого раствора или 1 г ткани с учетом объема белкового экстракта и разведения.

Контрольные вопросы. 1.Каков принцип определения содержания белка методом Лоури? 2. Как избежать завышенных результатов определения содержания белка в белковых экстрактах по методу Лоури? 3. Каков диапазон достоверно определяемых концентраций белка методом Лоури?

Задания.1. Построить калибровочную кривую для определения концентрации белка по методу Лоури в соответствии с полученными данными. 2.Определить концентрацию белка в исследуемом прнепарате белка по калибровочной кривой. 3. Рассчитать содержание белка в мг на 1 г ткани.

Практическая работа № 19