Клонирование фрагментов ДНК в клетках

Е. соli

 

Клонирование — биотехнологический процесс, позволяющий
получать идентичные копии фрагментов ДНК, генетически идентичные клетки или организмы в практически неограниченном количестве. Клонирование ДНК позволяет из единичного фрагмента ДНК получить большое количество его копий, достаточное,
чтобы выделить этот фрагмент как химически чистое вещество и
проанализировать его (секвенировать или экспрессировать входящие в его состав элементы). Есть два основных подхода к клонированию ДНК:

• клонирование ДНК in vivo (с использованием живой системы — вирусов, клеток микроорганизмов,чаще всего Е.соli, и дрожжей; в англоязычной и переводной литературе такие клоныДНК чаще называют искусственными хромосомами, соответственно virus, Ьасteria и yast artificial chromosome, сокращенно
VАС, ВАС и YАС);

• амплификация методом ПЦР (клонирование ДНК in vitro).

ПЦР — более удобный для исследователей подход, так как система in virto более предсказуема и технологична, однако этот метод
имеет два серьезных недостатка. Во-первых, используя ПЦР,
нельзя клонировать достаточно протяженные фрагменты ДНК.
Так, при использовании специальной высокопроцессивной и точной ДНК-полимеразы (типа Pfu ДНК-полимеразы) длина амплифицируемых фрагментов превышает 10 тыс. п.н.,а при использовании «обычной» TagДНК-полимеразы она составляет не более
3—4 тыс. п.н., а чаще только 1—2 тыс. п.н. Во-вторых, система in vitro не защищена от ошибок, которые допускают любые полимеразы в процессе матричного синтеза ДНК (TagДНК-полимераза 2—3 нуклеотида на каждые 10 тыс. п.н.), эти ошибки, воспроизводясь с каждым циклом ПЦР, накапливаются вместе с целевым
фрагментом.

В отличие от ПЦР, фрагмент ДНК, клонированный в живой
системе (in vivo), особенно в бактериальной или дрожжевой клет
ке, воспроизводится с гораздо большей точностью, поскольку
ошибки, допускаемые ДНК-полимеразой, исправляются ферментами системы ДНК-репарации (так, частота ошибок ДНК, клонированной в Е. соli, составляет 1 нуклеотид на 10⁶п.н.,в дрожжах 1 нуклеотид на 10⁷—10⁸ п.н.). Длина фрагмента, клонированного в
бактериальных клетках, может составлять около 100 тыс. п.н., а в
дрожжевых клетках она практически не ограничена (может достигать размера целой хромосомы — около 1 млн п.н.). Основной недостаток клонирования in vivo — низкая технологичность,а именно сложность и многостадийность процесса, зависящего от большого числа факторов, связанных с жизнедеятельностью клеточ
ных культур, которые нужно предварительно готовить, постоянно
поддерживать, наращивать, что занимает значительное время.

Процесс клонирования ДНК in vivo состоит из нескольких этапов:

подготовка фрагмента ДНК и вектора для его клонирования;

получение рекомбинантной ДНК (гибридизация и лигирование);

трансфекция и трансформации клеток;

отбор трансформированных клонов, наращивание клеточной массы;

выделение продуктов клонирования (рис. 17).

Фрагмент ДНК, вырезанный с помощью рестриктазы (фермент, катализирующий разрывы в цепях ДНК) или полученный с
помощью ПЦР, соединяется с молекулой вектора (молекула ДНК,
предназначенная для создания рекомбинантной плазмиды и пере-
носа ее в бактериальную клетку) с помощью ДНК-лигазы (фер-
мент, сшивающий одноцепочечные разрывы ДНК).

 

Рестриктазу подбирают таким образом, чтобы на векторе имелся только один сайт рестрикции, и такой же сайт выбирают в исходной ДНК (если фрагмент получают путем рестрикции) или воспроизводят на З'-конце олигонуклеотидного праймера для
ПЦР.

Клонируемый фрагмент ДНК и ДНК-вектор должны остаться
нетронутыми после специфичного действия рестриктазы, поскольку только в этом случае будет соблюдаться необходимое для
лигирования условие — наличие липких концов ДНК-вектора и
комплементарных им липких концов ДНК-фрагмента. В некоторых случаях, когда для формирования рекомбинантной плазмиды используется ПЦР-фрагмент, можно обойтись вообще без рестрикции. Дело в том, что TagДНК-полимераза, достигнув 5'-конца
матрицы, добавляет к З'-концу синтезируемого фрагмента некоторое количество нуклеотидов А, формируя так называемый поли(дА)-хвост — одноцепочечную ДНК. Для поли(дА)-лигирования создан ряд линейных векторов с поли(дТ)-хвостами, к которым по
правилу комплементарности присоединяются хвосты ПЦР-фрагмента, а лигаза, неспецифичная к последовательности сшиваемой ДНК, сращивает концы вектора и ПЦР-фрагмента, образуя кольцевую молекулу ДНК — рекомбинантную плазмиду.

Полученная рекомбинантная ДНК (рекомбинантная плазмида
или искусственная бактериальная хромосома — ВАС) используется для трансформации бактериальной клетки, в которой при каждом делении синтезируются новые копии рекомбинантной ДНК.Накопившуюся плазмидную ДНК выделяют особым образом, не
захватывая геномной ДНК бактерии и по возможности отделяя от
других бактериальных плазмид. Для этого применяют несколько
методов, например ультрацентрифугирование в градиенте плотности СsС1, гель-фильтрацию или сорбционную хроматографию.
В настоящей работе для выделения плазмид будет использован более простой, но широко распространенный метод щелочного лизиса.

Методы клонирования ДНК in vivo и in vitro не следует противопоставлять: они очень удачно дополняют друг друга.ПЦР—удобный метод получения фрагмента ДНК для последующего клонирования и наработки в больших (миллиграммовых) количествах
и в чистом виде, например для секвенирования, гибридизации (в
роли мишени или зонда), использования в качестве ДНК-стандартов или создания геномных библиотек (клонотик). Кроме того,
ПЦР в силу относительной простоты и оперативности используют
для поэтапного контроля процесса клонирования in vivo. В то же
время клонирование фрагментов ДНК производят необязательно
с целью амплификации ДНК-продукта. Искусственные хромосомы в трансформированных ими клетках бактерий или дрожжеймогут экспрессироваться (транскрибироваться)подобногеномнойДНК, а их транскрипты использоваться для биосинтез белков(при соответствии генетического кода и регуляторных сигналов
ДНК хозяина и чужеродной). Таким образом, клоны могут служить источником как РНК, так и целевого белка. Последнее направление очень перспективно и уже используется в промышленной биотехнологии (например, для получения инсулина человека с помощью микроорганизмов).

Для оптимальной работы используемых для клонирования
ферментов необходимо строгое соблюдение определенных условий реакции. Формирование искусственной хромосомы — также
непростой процесс, требующий точного знания последовательности нуклеотидов вектора и наличия его в чистом виде.Кроме того,желательно, чтобы вектор включал маркерный фрагмент, необходимый для детекции его правильного формирования и факта
трансформации им бактериальных клеток, а также для последую-щей селекции толькотрансформированныхштаммов,несущихвставку целевой ДНК. Такими маркерными фрагментами чаще всего служат гены устойчивости к антибиотикам (например,ампициллину) и реже гены хроматофоров или флюорофоров (например, зеленого белка медузы), которые окрашивают трансформированные клоны. Поэтому оптимальным для практической работы является использование готовых к употреблению наборовреагентов, в частности препаратов рестриктаз с соответствующими готовыми буферными растворами и наборов для лигирования
(вектор с точно определенной структурой, препарат ДНК-лигазы,
соответствующий ей буферный раствор и описание процедуры лигирования). Сейчас также доступны готовые штаммы бактериальных клеток (в лиофилизированном или замороженномсостоянии), специально подготовленные для успешной трансформации
(так называемые компетентные клетки с нарушенной клеточной
стенкой или вообще без нее, лишенные собственных плазмид).

Для выделения плазмидной ДНК предлагаются коммерческие
наборы, основанные на сорбции—десорбции ДНК с суспендированным или нанесенным на полупроницаемую мембрану сорбентом. Однако изложенный ниже метод щелочного лизисаменеесложен в использовании и достаточно широко применяется в молекулярно-биологических лабораториях, особенно для препаративных целей.

Цель работы. Научиться основным приемам клонирования
фрагментов ДНК.

Оборудование и материалы. 1. Термостат твердотельный для микропробирок
вместимостью 1,5 мл. 2. Термостат твердотельный с функцией охлаждения для
микропробирок вместимостью 1,5 мл. 3. Центрифуга рефрижераторная до 3000g
для пробирок вместимостью 50 мл. 4. Клеточный инкубатор (микробиологичес кий термостат-«качалка»), 5. Ламинарный бокс. 6. Термостат (водяная баня).
7. ПЦР-фрагмент гена 18S рРНК, очищенный методом электрофореза и элюированный из геля с помощью набора Diatom DNA Elution (см. практические работы
№ 7 и 8). 8. Набор реагентов для лигирования рGЕМ—Т («Ргоmega Со»), 9. Суспензионная культура клеток кишечной палочки Е. соli в среде LВ. 10. Жидкая
культуральная среда LВ: 10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaC1;
довести 1 М раствором NаОН до рН 7,5, водой до 1 л, автоклавировать 40 мин под
давлением 1 тех. атм (760 мм рт. ст.). 11. Агаризованная культуральная среда LВ с
ампициллином: 15 г бактоагара на 1 л жидкой среды ЬВ, растворить агар при кипя-
чении в микроволновой печи, автоклавировать 40 мин под давлением 1 тех. атм.,
охладить до 50—60 °С, добавить 200 мг натриевой соли ампициллина и переме-
шать для полного растворения, готовую среду сразу же разлить по чашкам Петри
(10—25 мл на каждую в зависимости от диаметра), чашки со средой закрыть, после
застывания перевернуть, хранить завернутыми в кальку при 2—8 °С. 12. 50 мМ раствор СаС1г (стерильный). 13. 100 мМ раствор СаС1₂ (стерильный). 14. 2 М раствор
глюкозы. 15. 1 М трис- HCIбуфер рН 8. 16. 0,5 М раствор ЭДТА—Na рН 8. 17. 1 М
раствор NaОН. 18. 10%-ный раствор ДДС-Иа. 19. 10 М раствор ацетата аммония.
20. 2 М раствор ацетата аммония. 21. Изопропанол. 22. ТЕ-буфер (10 мМ трис НС1, 1 мМ ЭДТА—Na рН 8). 23. Деионизованная вода.

Ход работы. Внимание! Все работы с культурами клеток Е. соН
производить в ламинарном боксе во избежание их загрязнения посторонней микрофлорой.

Подготовка рекомбинантной ДНК для клонирования. В качестве целевого фрагмента ДНК предлагается использовать ПЦР-фрагмент гена 18S рРНК, очищенный методом элюции с геля после электрофореза (см. практические работы № 7
и 8). Для прямого лигирования рекомендуется использовать линейный вектор с поли(дТ)-хвостами,такой,например,как рGЕМ-Т. Процедура лигирования производится в точном соответствии с протоколом к используемому набору реагентов.

Подготовка препарата компетентных клеток
Е. соli. Этот препарат необязательно производить каждый раз заново: можно использовать готовые препараты при условии хранения культуры при -70 °С.

1.Наращивают ночную культуру Е. соli в 10 мл среды LВ (16—
18 ч при 37 °С).

2.Суспендируют 1,5 мл ночной культуры Е. соli в 40 мл среды
LВ, предварительно подогретой до 37 ^oС.

3.Инкубируют суспензию при постоянном перемешивании
при 37 "С до тех пор, пока оптическая плотность суспензии, измеренная при 600 нм против чистой среды LВ, не достигнет значения около 0,4—0,6 (обычно на это требуется 2,5—3 ч).

4.Переносят суспензию в центрифужную пробирку вместимостью 50 мл и помещают в лед на 20 мин.

5.Центрифугируют клеточную суспензию 15 мин при 3000g и
4 ^oС.

6.Осторожно, как можно более полно удаляют супернатант, к
осадку добавляют 20 мл стерильного и охлажденного на льду50 мМ раствора СаС1₂, осадок очень осторожно суспендируют (с
помощью стеклянной пипетки с оплавленным концом).

7.Помещают пробирку в лед на 20 мин.

8.Центрифугируют клеточную суспензию 15 мин при 3000 g и 4 °С.

9.Осторожно, как можно более полно удаляют супернатант, к
осадку добавляют 4 мл стерильного и охлажденного на льду
100 мМ раствора СаС1₂, осадок очень осторожно суспендируют (с
помощью стеклянной пипетки с оплавленным концом).

10.Готовый препарат компетентных клеток распределяют по
отдельным микропробиркам (по 20 мкл).

Внимание! Хранить препарат при 2—8°С не более 18 ч или при
— 70 °С не более 2 мес.

Трансформация клеток Е.coli, селекция трансформированных штаммов и наращивание клеточной массы.1.К20мкл препарата компетентных клеток обавляют 40 нг плазмидной ДНК (рассчитывают требуемый
объем раствора реакционной смеси в соответствии с описанием к
используемому набору реагентов для лигирования).

2.Cмешивают жидкости очень осторожным и мягким встряхиванием.

3.Помещают суспензию в лед на 30 мин.

4.Производят «тепловой шок»: нагревают суспензию клеток до
42°С на водяной бане, выдерживают 40 с и снова помещают в лед
на 10 мин.

5.Добавляют к суспензии 80 мкл жидкой среды LВ, аккуратно
перемешивают и инкубируют 2—4 ч в клеточном инкубаторе при
37 "С и постоянном перемешивании со скоростью 225 g.

6.Высевают клетки на агаризованную среду LВ с ампициллином, для этого переносят всю клеточную суспензию на поверхность среды в чашке Петри и равномерно распределяют ее с помощью шпателя.

7.Инкубируют чашки при 37°С в течение ночи (16—18 ч).
8.Отбирают с помощью микробиологической петли одну из
колоний трансформированных клеток (нетрансформированные
клетки, не содержавшие рекомбинантной плазмиды, не обладают
устойчивостью к ампициллину и не растут на среде с этим антибиотиком) и переносят клетки в 10 мл жидкой среды LВ.

9.Инкубируют в течение ночи (16—18 ч) в клеточном инкубаторе при 37 °С и постоянном перемешивании со скоростью 225g. Готовую ночную культуру используют немедленно.

Выделение плазмидной ДНК. 1. Отбирают 1,5мл
ночной культуры трансформированных клеток в микропробирку
вместимостью 1,5 мл, центрифугируют 30 с при 5000g, супернатант удаляют. Повторяют это еще 2 раза в той же пробирке для
увеличения массы осадка.

2.Центрифугируют дополнительно 10 с при 5000g, супернатант
полностью удаляют.

3.Далее выделение плазмидной ДНК проводят по описанию,
представленному в практической работе № 5, начиная с п. 4.

 

Контрольные вопросы. 1. Как действуют ДНК-лигазы? 2. Какова роль ДНК-лигаз в живой клетке? 3. Каковы оптимальные условия реакции лигирования?
4. Каковы основные этапы процесса клонирования ДНК? 5. Какую роль играют
лигаза, рестриктаза, ДНК-полимераза в процессе клонирования? 6. Что представляет собой рекомбинантная ДНК? 7. Каким образом можно проверить промежуточные и конечный результаты трансформации клеток и клонирования ДНК?

 

Задания. 1. Получить клонированный фрагмент ДНК в виде рекомбинантной ДНК. 2. Измерить концентрацию ДНК и охарактеризовать качество полученного препарата спектрофотометрическим методом. Сделать вывод о пригодности полученного материала для последующей молекулярно-биологической работы.

 

Практическая работа № 13
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ДНК

 

Первичная структура ДНК — последовательность составляющих ее нуклеотидов. Чаще всего имеется в виду прямая(ведущая)цепь двухцепочечной молекулы ДНК. Она не служитматрицейдля синтеза РНК (нематричная цепь ДНК), и обычно структуру
именно этой цепи приводят в данных по строению ДНК или отдельных генов, при этом слева располагают 5'-,а справа 3'-конец цепи.

Определение последовательности нуклеотидов ДНК, или секвенирование (от англ. зедиепсе — последовательность), — важнейший элемент расшифровки геномов, молекулярной идентификации живых организмов, выявления структуры и функций генов,производства направленных изменений наследственной информации и др. Первым методом секвенирования ДНК стал прямой
ферментативный метод, предложенный Ф. Сэнджером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров — синтетические олигонуклеотиды или фрагменты, полученные при гидролизе ДНК рестриктазами, а в качестве фермента — фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I (Ро11) из
Е. соli. Метод включал два этапа. На первом этапе проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов дНТФ(один из которых радиоактивно мечен ³³Р), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричной ДНК. На вто-ром этапе эти продукты очищали от несвязавшихся дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и использовали для серии полимеразных реакций либо только с каким-то одним дНТФ в каждой(«плюс»система), либо с тремя дНТФ, исключая те, что участвовали в
«плюс» системе («минус» система). В результате во всех реакциях в
определенный момент происходило прерывание синтеза, причем
в «плюс» системе — сразу после включения единственного участвующего в реакции дНТФ, в «минус» системе, где такой дНТФ
отсутствовал, — перед ним. Полученные таким образом восемь
образцов подвергали электрофорезу, радиоавтографировали его и
определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом,
например, была секвенирована ДНК фага φХ174, состоящая из
5386 п.н.

Позже данный метод значительно усовершенствовали благодаря возможности использования специфических терминаторов синтеза ДНК — 2',3'-дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ддНТФ). Метод стал гораздо технологичнее и в несколькомодифицированном виде применяется до сих пор, будучи реализованным в автоматическом режиме. В основе метода лежит также ферментативное копирование матричнойДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из Е. соli при использованиисинтетических олигонуклеотидных праймеров, при этом специфическую терминацию синтеза обеспечивают добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов дНТФ (один из них радиоактивно мечен ³³Р) одного из ддНТФ (ддАТФ, ддТТФ, ддЦТФ или ддГТФ), который включается в растущую цепь ДНК и таким образом обрывает ее дальнейший рост из-за отсутствия 3'-ОН-группы.
Продукты реакции, так же как и в «плюс»—«минус» системе, подвергают электрофорезу, при этом чем короче фрагмент, тем дальше он смещается от старта электрофореза. В итоге последовательность нуклеотидов считывают с радиоавтографа в направлении от
фронта к старту и в соответствии с тем, какой из ддНТФ был использован для получения набора фрагментов на каждой из четырех дорожек электрофореграммы (рис. 18).

В настоящее время для получения меченых фрагментов ДНК
используют не радиоактивную, а флуоресцентные метки, включенные непосредственно в ддНТФ и подобранные таким образом, чтобы длины волн испускаемого ими света различались. Это позволяет проводить все четыре реакции в одной пробирке и разделять продукты на одной дорожке геля, а детектировать их с использованием соответствующих светофильтров. Кроме того, для
проведения реакции теперь используют термостабильные и высокоточные ферменты, обладающие высокой процессивностью и позволяющие секвенировать ДНК и ПЦР. Последнее очень важно для повышения чувствительности и соответственно уменьшения количества требуемой для секвенирования ДНК. Кроме того, электрофорез и детекцию субфрагментов ДНК реализуют мейчас в автоматическом режиме с помощью приборов для капиллярного электрофореза с лазерными детекторами высокого разрешения.Время секвенирования существенно сократилось (до 1,5-2ч), а последовательность нуклеотидов, которую можно расшифровать за один прием, увеличилась (до 600-700 п.н.)

Другой метод, предложенный А.Максамом и У. Гилбертом, основан на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиактивно-меченого с одного концв. После концевого мечения препарат ДНК разделячли на четыре аликвоты и каждую обработатывали реагентом, модифицирующим одно илит два из четырех оснований. В частности, пуриновые остатки метилировалди диметилсульфатом, затем метиладенин отщепляли соляной кислотой, а метилгуанин-пиперидином при температуре 0⁰С. Полученный препарат инкубировали при 90⁰С в щелочной среде и тем самым разрывали сахарофосфатную цепь в местах отщепления оснований. Пиримидинговые основания модифицировали гидразином.Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин, если в присутствии 2 М NaCI – только цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае
осуществляют пиперидином. Условия реакций подбирали таким
образом, чтобы получить в итоге полный набор субфрагментов
разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном
геле позволял восстановить полную структуру исследуемого фрагмента. Теоретически этот метод можно было бы автоматизировать, причем не только процедуру электрофореза, но и все подготовительные стадии обработки ДНК, однако широкого распространения метод не получил и в настоящее время практически не
используется.

 

 

 

 

Цельработы. Ознакомиться с секвенированием ДНК методом Ф. Сэнджера.

Оборудование и материалы.1.Термостат твердотельный для микропробирок в местимостью 0,5—1,5 мл. 2. Микроцентрифуга до 12000g. 3. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 4. Термостат (водяная баня). 5. Вакуумная установка, собранная из водоструйного насоса и круглодонной колбы на
200 мл с притертой крышкой. 6. Прибор для вертикального электрофореза в
>ПААГ (лучше специальный, предназначенный для электрофореза нуклеиновых кислот пластиной размером 20x50 см, принудительным охлаждением и возможностью формировать гель толщиной 1 мм и менее). 7. Вакуумный термостат. 8. Микропробирки вместимостью 0,5—0,6 мл. 9. ДНК-матрица для секвенирования (например, ПЦР-продукт, полученный с ДНК растительного или животного происхождения специфичными для гена 18S рРНК олигонуклеотидными праймерами и очищенный методом электрофореза и элюции ДНК из геля; см. практические работы № 7, 8). 10. Раствор праймера для секвенирования, 2,22 нг/мкл [может использоваться любой из тех, что были взяты для получения ДНК-матрицы на основе гена 18S рРНК (см. ранее), однако для удобства чтения последовательности лучше взять прямой праймер, гомологичный 3'-концу обратной (матричной) цепи ДНК-матрицы, в этом случае прочитанная последовательность будет соответствовать прямой цепи ДНК)].11.Набор реагентов для секвенирования (например, Т7 Sequencing Kit производства Pharmacia).12. 2 М раствор NaОН. 13. 3 М ацетатный буферный раствор рН 4,5. 14. Стерильная деионизованная вода. 15. Абсолютный (100%-ный) этанол. 16. 96%-ный этанол. 17. 70%-ный этанол. 18.7хбуферный раствор для отжига (280 мМ трис-HCI буфетный раствор _Рн 7,5, 100 мМ МgС1₂350 мМ NaС1). 19. Стоп-раствор (95%-ныи деионизованныи формамид 20 мМ ЭДТА-Nа_РН7,5, 0,1%-ный бромфеноловый синий, 0,1%-ный ксиленцианол).20. 6%-ный раствор акриламида (5,7%-ный акриламид, 0,3%-ный метилен-бис-акриламид, 48%-ная мочевина, 1х ТВЕ-буфер). 21. 25%-ный раствор персульфата аммония. 22. ТЕМЭД. 23. Фиксирующий раствор: 10%-ная уксусная кислота,10%-ный метанол. 24. Бумага ватман 3 ММ. 25. Фильтровальная бумага. 26. ТВЕ- буфер рН 8 0: трис – 10,8 г, борная кислота -5 5 г, эдта-Na₂х2Н₂о - 0,93 г, Вода - до 1 л.

 

Ход работы (по методу Сэнджера с использованием терминатометилгуанин — пиперидином при температуре 0 °С. Полученный ров синтеза в интерпретации с применением комплекта реагентов препарат инкубировали при 90°С в щелочной среде и тем самым Pharmacia Со).

1.Готовят раствор ДНК с концентрацией 350—400 нг/мкл (можно использовать продукт ПЦР после его элюции из агарозногогеля — см. практические работы № 7 и 8), в микропробирку вносят 8 мкл готового раствора ДНК.

2.Добавляют 2 мкл 2М раствора NaОН, интенсивно перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре для денатурации ДНК.

3.Добавляют 3 мкл 3 М ацетатного буферного раствора и 7 мкл
стерильной деионизованной воды, перемешивают и добавляют
60 мкл 96%-ного этанола, еще раз аккуратно перемешивают.

4.Центрифугируют 10 мин при 12 000g супернатант полностью удаляют, осадок ДНК аккуратно ополаскивают 20мкл 70%-ного этанола, высушивают на воздухе в открытой пробирке, а затем растворяют в 10 мкл стерильной деионизованной воды.

5.Добавляют 2 мкл раствора праймера (2,22 нг/мкл) и 2 мл
7хбуфера для отжига. Нагревают смесь до 65°С, выдерживают при
этой температуре 2 мин и медленно охлаждают при комнатной
температуре (не менее 30 мин).

6.Разделяют смесь на четыре пробирки, подписав каждую в соответствии с названием нуклеотидов(например,А,Т,ГиЦ).Следуя инструкции к используемому набору реагентов для секвенирования, проводят реакцию синтеза—мечения субфрагментов ДНК
(например, при использовании Т7 Sequencing Kit добавляют в
каждую из четырех пробирок с ДНК-матрицей 2,5мкл смеси
дНТФ, 1 мкл соответствующего ддНТФ с меткой, 2 мкл раствора labelling mix, 1 мкл 300мМ раствора дититреитола,2 мкл раствора Т7 ДНК-полимеразы (1,5 ед. акт/мкл); аккуратноперемешивают пипетированием; инкубируют 2—5 мин при температуре 4 °С; по 4,5 мкл смеси отбирают и вносят в новые пробирки с 2,5 мкл раствора termination mix,предварительнмаркированные и нагретые до 37°С; выдерживают еще 2—5минпри 37 °С; добавляют по 5 мкл стоп-раствора, аккуратно перемешивают пипетированием, до использования хранят при температуре —18 °С).

Приготовление геля для секвенирования и
проведениеэлектрофореза.1.Тщательно отмывают стеклянные пластины прибора для электрофореза,используя детергенты, ополаскивают сначала дистиллированной водой,затем96%-ным этанолом.

Внимание! С этого момента со стеклянными пластинами работать только в перчатках!

Пластины сушат на воздухе и протирают фильтровальной бумагой до блеска.

2.Одну из стеклянных пластин (лучше переднюю — с вырезом
для гребенки) силиконизируют путем обработки 4%-ным раствором дихлордиметилсилана в гексане (равномерно распределяют
жидкость по всей поверхности стекла из расчета 0,5 мл на 100 см²
пластины),высушивают на воздухе при комнатной температуре,
однократно ополаскивают дистиллированной водой, затем абсо лютным этанолом, снова высушивают и протирают фильтровальной бумагой.

3.Собирают камеру для заливки геля толщиной слоя 0,25—
1 мм.

4.Готовят смесь для формирования геля-пробки (для герметизации камеры). Для этого аккуратно смешивают на холоду 7мл 6%-ного раствора акриламида, 30 мкл 25%-ного раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЭДа (объемы рассчитаны на пластину
геля площадью 20x50 см толщиной 0,5 мм).

5.Располагают камеру для геля горизонтально, заливают гельпробку в нижнюю часть камеры на 4—5 см. Гель должен формироваться примерно 5 мин при комнатной температуре, если для этого нужно больше времени, следует увеличить объемы персульфата аммония и ТЕМЭДа в смеси для приготовления геля.

6.Готовят смесь для основного геля. Для этого аккуратно смешивают на холоде 70 мл 6%-ного раствора акриламида,90мкл25%-ного раствора персульфата аммония и 90 мкл ТЕМЭДа (объемы рассчитаны на пластину геля площадью 20x50 см, толщиной
0,5 мм). С помощью водоструйного насоса смесь вакуумируют,
доводят до закипания и кипятят на холоде еще 1 мин для полного
удаления растворенных газов.

7.Устанавливают камеру для геля под углом около 10° к горизонту и аккуратно заливают внутрь смесь для основного геля, не
допуская образования пузырей. Помещают в заполненную камеру
гребенки для формирования лунок толщиной 0,25 мм (длина зубцов должна быть не менее10мм).Гельполимеризуется30±5минпри комнатной температуре, если для этого требуется больше времени, необходимо увеличить объемы персульфата аммония и
ТЕМЭДа в приготавливаемой для геля смеси. Готовый гель можно
хранить 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при
2—8 "С плотно завернутым в полиэтиленовую пленку для предотвращения высыхания.

8.Удаляют гребенку из геля, собирают камеру для электрофореза (от катода к аноду), заливают в нее 1хТВЕ-буфер,включают напряжение (1800 В на пластину геля шириной 20см и толщиной 0,5 мм) и проводят процесс пред-электрофореза, пока температура
геля и буфера не достигнет 55 °С.

9.Выключают напряжение. Промывают лунки путем инъекции
в них 1х ТВЕ-буфера с помощью автоматической дозатора.

10.Пробирки с реакционными смесями А, Т, С и С помещаютв кипящую воду на 2—3 мин для денатурации ДНК,после чего вносят в лунки геля по 3 мкл каждой пробы.

11.Включают напряжение (1800В на пластину геля шириной
20 см и толщиной 0,5 мм) и продолжают электрофорез до тех пор,
покакрасительксиленцианол(сине-голубогоцвета)не

на 5 см ниже линии старта. Необходимо поддерживать температуру буфера и геля на уровне 50—55 °С.

12.По окончании электрофореза выключают напряжение, разбирают прибор и удаляют силиконизированную стеклянную пластину с поверхности геля. Гель должен остаться на противоположной пластине.

Обработка гелевой пластины и визуализация
результата. 1. Гель вместе со стеклянной пластиной погружают
на 15—20 мин в фиксирующий раствор.

2.Переносят гель на лист ватмана ЗММ и сушат 75 мин в вакуумном термостате при температуре 85 "С.

3.Визуализируют субфрагменты на геле в соответствии с использованной меткой (радиоавтографии на рентгеновской пленке или сканирование в УФ-свете для детекции флуорофоров).

4.Прочитывают последовательность нуклеотидов в ДНК-матрице в направлении, противоположном электрофорезу.

Контрольные вопросы. 1. Каковы альтернативные методы определения первичной структуры ДНК? 2. В чем заключаются основные модификацииметодаФ. Сэнджера, позволившие автоматизировать процесс секвенирования ДНК? 3.Что является основным ограничением для секвенирования фрагмента ДНК за
один этап? 4. Как осуществляют секвенирование последовательностей ДНК, превышающих длину 500—700 п.н.?

Задания. 1. Определить первичную последовательность ДНК,
электрофорез субфрагментов которой приведен на рисунке 19.

2.Используя Интернет-базы данных (например,NCBI),установить наиболее близкие го-мологии с первичными структурами фрагментов,которые определены в результате секве-нирования или по изображенному на рисунке 19 радиоавтографу.

 

 

Рис.19.Схема радиоавтографа, полученного при секвенировании фрагмента ДНК:

А-прямая цепь; Б-обратная цепь ddATP,ddTTP, ddGTP и ddCTP-использованный в реакции дидезоксирибонуклеозидрифосфат (ддАТФ, ддТТФ, ддГТФ, ддЦТФ соответственно); стрелка-направление электрофореза (от катода к аноду).

 

 

Практическая работа № 14

ИНФОРМАЦИОННЫЙ ПОИСК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
БАЗ ДАННЫХ ИНТЕРНЕТА

 

Информационная сеть Интернет стала обычным атрибутом окружающей нас действительности. Однако для неподготовленного
пользователя далеко не все ее возможности очевидны. Прежде
всего необходимо знать, к каким ресурсам следует обращаться с
той или иной целью, соответствующие электронные адреса (хотя
их можно найти с помощью специальных поисковых систем). Затем нужно сформулировать цель поиска в одном или нескольких
ключевых словах, в крайнем случае в одной короткой фразе и, наконец, вооружившись временем и терпением, разобрать свалившуюся на ваш компьютер уйму ссылок, в большей или меньшей степени похожих на то, что вы искали. Успех поиска определяется
вашими способностями сформулировать запрос, сориентироваться в полученной информации и, выбрав какие-то новые ориентиры, быстро разработать новую или усовершенствовать старую стратегию поиска.

Самый простой пример — поиск научных статей по теме исследования, а также по авторам или названиям определенных организмов. Наиболее короткий путь — сайты (или электронные страницы) каких-либо библиотек соответствующей специализации. В частности, среди русскоязычных источников популярны
сайты:

1. Центральная научная сельскохозяйственная библиотека (http//www.cnshb.ru/

2. Библиотека естественных наук РАН (http.//www.benran.ru/).

3.Государственная публичная научно-техническая библиотека
России (http://gpntb.ru/).

4.Федеральная служба по интеллектуальной собственности,
патентам и товарным знакам Роспатент (http:www.fips.ru) и др.

Среди иностранных библиотек наиболее крупными считаются
библиотеки Springer (http:www.springer.com/). Medline, Biosis, Web of Science и Pub Med. На любом из указанных сайтов размещена строка поиска для указания ключевого слова или нескольких слов. После обработки запроса (в течение некоторого времени,
иногда до 10 мин, в зависимости от загруженности выбранного
вами сайта) вы получите ряд ссылок по определенным критериям,
соответствующим запросу. Дополнительную информацию о сайтах библиотек и некоторых журналов, а также большое количество ценных сведений по молекулярно-биологическимметодам,разнообразные справочные данные, доступ к программам раз-личных расчетов (например, приготовления растворов) можно по-
лучить на сайте для молекулярных биологов MolBiol (http://www.molbiol.ru/).

Следует иметь в виду, что ваши запросы обрабатывает машина,
преимущественно пользуясь одним простым алгоритмом — поиском указанных ключевых слов в названии, резюме или полном
тексте статей (часто в любом падеже и регистре). Соответственно
для составления верного запроса пользуйтесь определенными
правилами:

если слов больше, чем одно, и все они должны присутствовать
в найденном материале, их нужно разделять союзом «и» (and);

если в найденном материале должно присутствовать любое из
ключевых слов, но только одно, слова нужно разделять союзом
«или» (оr);

если возможен любой из вариантов поиска ключевых слов, никакого союза не нужно;

если в найденном материале должна присутствовать целая фраза, ее нужно брать в кавычки.

Помимо литературы, в Интернете имеются базы данных
иного рода. Наиболее яркий пример — NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Это крупный ресурс, включающий в себя в
том числе библиотеку PubMed, но наиболее ценен он огромной
коллекцией последовательностей ДНК, начиная от коротких
фрагментов с неустановленными функциями, фрагментов генов
или генов-гомологов до целых хромосом и даже геномов с указанием определенных генов.

Пользуясьэтойколлекцией,можноподобратьпоследовательности, характеризующие определенныйвид живого организма, или решить обратную задачу — выявить
уже опубликованные гомологи для известной последовательности
и установить ее предполагаемую роль в геноме (с помощью вло
женной программы NCBI). Аналогичную работу можно
проводить с РНК, белками, а также, что наиболее интересно, устанавливать их взаимоотношения и быстро находить соответствующие ссылки на литературу.

Изучению основных приемов работы с ресурсом посвящена практическая часть настоящей работы. Естественно, в пределах одной работы невозможно изложить все способы разработки научных проблем, однако систематическое обращение к инфор-мационным ресурсам, различающимся по специализации, способам поиска, логике представления материала и другим параметрам, очень скоро поможет полностью освоиться в Интернете.Без этого невозможно отслеживать новые публикации, а тем болеестроить схемы экспериментов и анализировать полученный мате-
риал.

Цель работы. Ознакомиться с основными приемами работы в
информационной сети Интернет.

Оборудование и материалы. 1. Компьютер, подключенный к сети Интернет.
2. Информация о первичной структуре ДНК, полученной в результате секвенирования и (или) чтения радиоавтографа (см. практическую работу № 13).

 

Ход работы. Поиск гомологичных последовательностей. 1. Открывают главную страницу Интернет-ресурса NCBI-Home Page, переходят на вкладку NCBI-Blast, выбирают гомологии типа ДНК—ДНК.

2.В открывшееся пустое окно вводят или копируют анализируемую последовательность нуклеотидов (латиницей!). Отправляют
запрос.

3.Полученные в новом автоматически открывшемся окне гомологичные последовательности будут представлены в порядке
убывания степени сходства, т. е. самые похожие расположены
вверху списка. Отбирают самые похожие (гомология может составлять 100 %), открывая их в новых окнах в виде стандартного
для NCBI описания.

4.Читаю

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: