 |
Характеристика электрофоретических фракций РНК из животных тканей
|
|
|
|
| Вид РНК |
Содержание каждой
| 18 А |
фракции РНК, %
общей РНК
| I II III |
| 154 112 70 |
| 2,1875 2,0492 1,8451 |
| 31 17 15 |
| 33,91 17,42 13,84 65,17 |
| 52,03 26,73 21,24 |
рРНК
рРНК
тРНК
Всего
Задания. 1. Провести фракционирование тотальной РНК методом электрофореза в ПААГ. 2. Рассчитать содержание каждой фракции РНК (%).
Занятие № 5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТЫ СЕДИМЕНТАЦИИ РНК
МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
В результате широкого применения электрофореза в ПААГ для
фракционирования белков и нуклеиновых кислот установлено,
что электрофоретическая подвижность биополимеров обратно
пропорциональна константе седиментации, а следовательно, и относительной молекулярной массе. Если в исследуемом образце
имеется компонент с известной относительной молекулярной
массой (или константой седиментации), то можно рассчитать значения указанных величин для других компонентов. В качестве образцов РНК с известной константой седиментации используют р ибосомальные РНК, выделенные из кишечной палочки Е. соН (соответственно 238 и 168) или из печени крысы (соответственно
288 и 188).
Цель занятия. Научиться определять константу седиментации
(или относительной молекулярной массы) РНК методом электрофореза в полиакриламидном геле.
Ход работы. На три колонки с ПААГ наносят 0,01—0,05 мл раствора, содержащего 30—60 мкг РНК, выделенной из анализируе-
мой ткани животного или клеток бактерий, на две другие —
столько же РНК из печени крысы и РНК из Е. соН. Колонки помещают в общий электрофоретический блок и проводят электрофо-
рез. Условия проведения электрофореза и обработки колонок с
полиакриламидным гелем аналогичны тем, что указаны в заня-
тии № 4.
Задания. Определить относительную электрофоретическую
подвижность каждой фракции РНК по отношению к краске-лиде-
ру. 2. На основании полученных данных построить график зави-
симости электрофоретической подвижности от константы седи-
ментации для фракции РНК печени крысы и Е. соН. Для этого по
оси ординат отложить величины константы седиментации (288 и188, 238 и 168) или значения относительной молекулярной массы
РНК, по оси абсцисс — их относительную электрофоретическую
подвижность. 3. По величине электрофоретической подвижности
высокомолекулярных фракций РНК анализируемой ткани опре-
делить константы седиментации этих фракций или значения от-
носительных молекулярных масс.
|
|
|
Практическая работа № 4
ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОРБЕНТОВ
В настоящее время наряду с классическими (см. практическую
работу № 3) широкое применение нашли методы выделения нуклеиновых кислот, использующие принцип их сорбции—десорбции
в процессе выделения и очистки. ДНК или РНК, полученные в
результате клеточного лизиса, связываются с сорбентом и в таком
состоянии проходят все стадии очистки, а затем в результате элюции переходят в раствор. В качестве сорбента широко применяют
частицы SiO2, в ряде случаев связанные с железом.
В настоящее время производится целый ряд коммерческих наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот методом сорб-ции. Использование таких наборов обеспечивает минимальные потери и высокое качество выделенной нуклеиновой кислоты при минимальных затратах времени. Использование наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот на сорбентах позволяет
исключить из процесса вредные для здоровья человека вещества
(все компоненты наборов в применяемых концентрациях нетоксичны) и стандартизировать выход ДНК.
Наборы реагентов БхаЮт™ БМА Ргер 100 и В1а1от™ 1ША
Ргер 100 (ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ») позволяют очистить
ДНК и РНК соответственно после сорбции нуклеиновых кислот
на суспендированных частицах SiO 2 (NucleoS™-сорбент) из лизата клеток, полученного при использовании лизирующего реагента
с гуанидинтиоцианатом. Этот реагент предназначен для лизиса
клеток, солюбилизации (растворения) клеточного дебриса и денатурации клеточных нуклеаз.В присутствии лизирующего реагента ДНК и РНК активно сорбируются на NucleoS™-сорбенте. Последующая очистка нуклеиновых кислот, связанных с сорбентом,от возможных сопутствующих примесей производится спиртовым раствором ацетата калия (рабочий раствор солевого буфера), и,
наконец, отделение фрагментов ДНК и РНК от частиц сорбента
(растворение, элюция) наиболее полно обеспечивается суспензи-
ей ионообменных смол (ЭкстраГенЕ™). Для растворения нуклеиновых кислот на этом этапе можно использовать стерильную деионизованную воду или буфер ТЕ, однако потери ДНК при элю-
ции возрастут на 15 —20 %.
|
|
|
Цель работы. Освоить методы выделения нуклеиновых кислот с
использованием сорбентов.
Оборудование и материалы. 1. Термостат твердотельный для микропробирок до
65 °С. 2. Микроцентрифуга высоскоростная до 10 000 #. 3. Микроцентрифуга-вортекс для микропробирок. 4. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 5. Микропробирки вместимостью 1,5 мл. 6. Цилиндр мерный вместимостью 200—500 мл. 7. Пестик-гомогенизатор для микропробирок вместимостью 1,5 мл. 8. Перчатки латексные неопудренные. 9. 96%-ный этанол. 10. Вода
дистиллированная. 11. Образец свежей животной или растительной ткани для выделения ДНК и РНК. 12. Набор реагентов Diatom™ DNA Ргер 100, включающий:
Lysis reagent! (лизирующий реагент), Saline buffer (10х солевой буфер), NucleoSTM
(суспензия сорбента), Extra Gene Е™ (ЭкстраГен Е™, суспензия смеси ионообменников). 13. Набор реагентов Diatom™ RNA Ргер 100, включающий:RNA Lysis
Reagent (лизирующий реагент), ЕxtraGeneЕ™ (ЭкстраГен Е™), суспензия смеси
ионообменников, NucleoS™ (суспензия сорбента для РНК), Saline buffer (5х соле-
вой буфер).
Занятие № 1
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА
D1АТОМ™ DNA PREP 100
Набор реагентов Diatom™ DNA Ргер 100 эффективен для выделения высокомолекулярной геномной ДНК (40—50 тыс. п.н.)
как прокариот, так и эукариот и обеспечивает высокую чистоту
выделенной ДНК. Потери ДНК при выделении не превышают
20 %. Очищенная ДНК может быть использована в дальнейшем
для любых молекулярно-биологических исследований (например,
амплификации методом ПЦР).
|
|
|
Ход работы. 1. Содержимое флакона с концентратом солевого
буфера полностью переносят в мерный цилиндр, доводят объем
раствора до 100 мл дистиллированной водой, а затем до 300 мл
96%-ным этанолом и перемешивают. Хранить рабочий раствор солевого буфера следует в плотно закрытой емкости при температуре
2-8 "С.
2. Вносят исследуемую пробу (образец свежей животной или растительной ткани) в микропробирку вместимостью 1,5 мл. Добавляют в пробирку 400 мкл лизирующего реагента, гомогенизируют пробу с помощью пестика-гомогенизатора до однородного СОСТОЯНИЯ- Внимание! Долгое хранение лизирующего реагента при температуре 2—8 °С может привести к кристаллизации, в этом случае перед использованием его необходимо подогреть на водяной бане или в термостате (50—60 °С) и перемешать до полного растворения
осадка.
4. Инкубируют пробу в термостате 40—60 мин при 65 °С.
5. По окончании инкубации содержимое пробирки встряхивают на вортексе.
Внимание! Если содержимое пробирки полностью затвердело во
время инкубации в термостате (например, если выделение ДНК производилось из муки или других высоко крахмалистых продуктов),в эту же пробирку необходимо добавить еще 200мкл лизирующего реагента и тщательно встряхнуть на вортексе.
6. Центрифугируют пробирку 10 мин при 10 000 §. Надосадочную жидкость, не задевая осадка, полностью отбирают с помощью автоматического дозатора и переносят в чистую пробирку.
7. Добавляют в пробирку 20 мкл суспензии сорбента. Перед использованием сорбент следует суспендировать на вортексе до исчезновения осадка.
8. Содержимое пробирки встряхивают на вортексе и выдерживают 7—10 мин, периодически перемешивая содержимое переворачиванием плотно закрытой пробирки 5—6 раз.
9. Центрифугируют 1 мин при 5000
10. Надосадочную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора или декантацией.
11. К осадку добавляют 200 мкл лизирующего реагента, содеримое пробирки встряхивают на вортексе до полного суспендирования осадка.
|
|
|
12. Добавляют в пробирку 800 мкл рабочего раствора солевого
буфера, содержимое перемешивают, переворачивая пробирку 5—6
раз.
13. Центрифугируют 10—20 с при 2000 §.
14. Надосад очную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора или декантацией.
15. К осадку добавляют 1 мл рабочего раствора солевого буфера, содержимое пробирки встряхивают на вортексе до полного
суспендирования осадка.
16. Центрифугируют 10—20 с при 2000 §.
17. Надосад очную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора или декантацией.
18. Повторяют операции, изложенные в пп. 15—17.
Внимание! В последний раз надосадочную жидкость необходимо
удалить как можно более полно, не задевая при этом осадка.
19. Осадок сушат 5—7 мин при 65 "С.
20. К высушенному осадку добавляют 75 мкл ЭкстраГена Е™.
Внимание! Перед использованием ЭкстраГен Е™необходимо пол-
ностью суспендировать, переворачивая плотно закрытый флакон 5 —
6 раз.
21. Встряхивают содержимое пробирки на вортексе до полного
суспендирования осадка.
22. Выдерживают пробирку 10 мин при 65 "С, содержимое пробирки еще раз встряхивают на вортексе.
23. Центрифугируют пробирку 1 мин при 10 000 §.
24. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) целиком переносят в чистую пробирку, ни в коем случае не задевая осадка и недопуская попадания сорбента в пробирку. Хранить полученный раствор ДНК при —18 °С, а при частом использовании — при 2—8 °С.
Занятие № 2
ВЫДЕЛЕНИЕ РНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА
Р1АТОМ™ ЯМ РВЕР 100
Набор реагентов О1а1;от™ 1ША Ргер 100 применяют для выделения тотальной РНК из клеток как прокариот,так и эукариот.
Очищенная РНК может быть использована в дальнейшем для проведения реакции обратной транскрипции.
Ход работы. 1. Содержимое флакона с концентратом солевого
буфера полностью переносят в мерный цилиндр, доводят объем
раствора до 50 мл дистиллированной водой, а затем до 300 мл
96%-ным этанолом и перемешивают. Хранить рабочий раствор солевого буфера следует в плотно закрытой емкости при температуре2-8 'С.
2. Вносят исследуемую пробу (образец свежей животной или
растительной ткани) в микропробирку объемом 1,5 мл.
3. Добавляют в пробирку 400 мкл лизирующего реагента и перемешивают.
4. Инкубируют пробу в течение 20 мин в термостате при 65 °С.
5. Добавляют в пробирку 20 мкл суспензии сорбента. Перед использованием сорбент следует суспендировать на вортексе до исчезновения осадка!?
6. Содержимое пробирки встряхивают на вортексе и выдерживают 7—10 мин, периодически перемешивая содержимое переворачиванием плотно закрытой пробирки 5—6 раз.
|
|
|
7. Добавляют в пробирку 800 мкл рабочего раствора солевого буфера, содержимое перемешивают, переворачивая пробирку 5—6 раз.
8. Центрифугируют 10—20 с при 5000 §. ■ ■/
9. Надосадочную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора или декантацией.
10. К осадку добавляют 1 мл рабочего раствора солевого буфера, содержимое пробирки встряхивают на вортексе до полного суспендирования осадка.
11. Центрифугируют 10—20 с при 5000 §.
12. Надосадочную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора или декантацией.
13.Повторяют операции, изложенные в пп. 10—12.
Внимание! В последний раз надосадочную жидкость необходимо
удалить как можно более полно, не задевая при этом осадка.
14.Осадок сушат 5—7 мин при 65 "С.
15.К высушенному осадку добавляют 100 мкл ЭкстраГена Е™
и суспендируют содержимое пробирки на вортексе дважды по 5—10 с с интервалом в 15 мин до получения гомогенной суспензии.
Внимание! Перед использованием ЭкстраГен Е™ необходимо полностью суспендировать и отбирать при перемешивании.
16. Центрифугируют пробирку 1 мин при 10 000 #.
17. Надосадочную жидкость (раствор РНК) целиком переносят
в чистую пробирку. Хранить полученный раствор РНК не рекомендуется, желательно сразу использовать для ОТ!
Контрольные вопросы. 1. Каковы основные этапы выделения и очистки нуклеиновых кислот при использовании методов сорбции? 2. Каково действие гуанидинтиоцианата? 3. С какой целью применяется солевой буфер? 4. Какова роль суспензии ионообменников?
Задания. 1. Получить препарат ДНК растительного происхождения. 2. Получить препарат РНК растительного происхождения.
Практическая работа № 5
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ
РЕКОМБИНАНТНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Бактерии, помимо хромосомной ДНК, несут один или более
небольших генетических элементов — плазмид, которые реплицируются независимо от хромосомной ДНК и обладают радом специфических свойств, позволяющих использовать их в генетической инженерии. Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные замкнутые кольцевые молекулы ДНК, размер которых
варьирует от 1 до 200 тыс. п.н. (для сравнения — размер бактериальной хромосомы составляет около 3 млн п.н.).
Основное свойство плазмид — их способность к автономной
репликации. При этом некоторые плазмиды (например, р11С,
рСЕМ) реплицируются с образованием большого числа копий.
Данный процесс осуществляется при наличии в плазмиде одного
или нескольких сайтов начала репликации — оп-сайтов, а также
генов, продукты которых принимают участие в этом процессе.
Кроме того, плазмиды могут содержать гены устойчивости к антибиотикам (например, к ампициллину - ген атрг) или другие маркерные гены, что позволяет проводить их эффективный отбор по данному признаку (рис. 4).
Для выделения плазмид используют клеточные культуры, как
растущие в жидкой среде, содержащей соответствующий антибиотик, так и полученные наращиванием одной снятой с агара бактериальной колонии.
Для выделения плазмидной ДНК (пДНК) чаще всего используется представленный ниже щелочной метод, обладающий рядом преимуществ по сравнению с другими методами выделения пДНК: он недорогой, быстрый и позволяет получить ДНК высокого качества.
Принцип метода. В щелочных условиях происходит денатурация (разделение цепей) линейных молекул хромосомной ДНК, а
кольцевые молекулы плазмидной ДНК этому процессу практически не подвергаются из-за своей компактной структуры, обусловленной суперскрученностью и малыми размерами. При нейтрализации клеточного экстракта в присутствии солей высокой концентрации происходит реассоциация одноцепочечных молекул хромосомной ДНК с образованием нерастворимых комплексов, которые выпадают в осадок. Таким образом, происходит разделение хромосомной и плазмидной ДНК. Удаление клеточной РНК и
белков в процессе осаждения происходит под действием детергента (ДДС—№) и (или) гидролитическихферментов(РНКазы,протеиназы).
Рис. 4.
Схемастроенияплазмидноговектора рСЕМф-32.Размер вектора —2743п.н.
атрг—генустойчивостикампициллину,1ас Ъ —фрагмент лактозного оперона кишечной палочки, оп точка начала репликации(стрелкойпоказанонаправлениерепликации. Штрихами обозначены сайты
рестрикции различными рестриктазами)
Цель работы. Ознакомиться со щелочным методом выделения плазмидной ДНК.
Оборудование и материалы. 1. Микроцентрифуга высокоскоростная (до
10 000#). 2. Термостат твердотельный для микропробирок вместимостью 0,5—
1,5 мл. 3. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками.
4. Микропробирки вместимостью 1,5 мл. 5. Термостат твердотельный с функцией
охлаждения для микропробирок вместимостью до 1,5 мл. 6. Петля микробиологическая. 7. ТЕ-буфер (10 мМ трис-ПС\, 1 мМ ЭДТА-№ рН 8). 8. 5 М раствор ацетата калия рН 4,8. 9. Изопропанал. 10. 70%-ный этанол. 11. ДНК плазмидырСЕМ-72Г. 12. ДНК плазмиды рСЕМ-32 с концентрацией 0,2; 0,5; 1,0мкг/мкл.13. Для проведения электрофореза используются материалы и оборудование,представленные в практической работе № 2.
Ход работы. 1. Готовят рабочие растворы I и II для выделения
плазмидной ДНК (табл. 5, 6).
|
|
|
