 |
Синтез белков
|
|
|
|
Синтез белка это сложный многоступенчатый процесс, основными этапами которого являются транскрипция, активация аминокислот и трансляция. Рассмотрим основные этапы синтеза белка.
Транскрипция. Специфика того или иного белка определяется набором аминокислот и порядком их соединения в белковой молекуле. Набор аминокислот и порядок их соединения закодирован в молекуле ДНК с помощью последовательности нуклеотидов. Каждая аминокислота кодируется тремя расположенными рядом нуклеотидами – триплетами или кодонами. Главным отличительным свойством различных нуклеотидов являются входящие в их состав азотистые основания, которых в ДНК встречается четыре вида: аденин, гуанин, тимин и цитозин. Сочетаниями из трех азотистых оснований можно образовать 64 различных триплета.
Молекулы ДНК находятся в ядре и не принимают непосредственного участия в синтезе белка. Информация о последовательности аминокислот в той или иной молекуле белка передается от ДНК к местам синтеза с помощью информационной РНК (и-РНК). Транскрипция - это процесс синтеза и-РНК на участке ДНК, несущем информацию о последовательности аминокислот в конкретной молекуле белка. Такой участок ДНК называется геном или цистроном.
Транскрипция начинается с разрыва водородных связей между двумя комплементарными цепями ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Затем происходит раскручивание спирали ДНК на участке, несущем нужную для синтеза белка информацию. Завершается транскрипция синтезом и-РНК при участии фермента РНК-полимеразы. В результате информация о последовательности аминокислот в белковой молекуле переносится в и-РНК. И-РНК выходит из ядра в цитоплазму и присоединяется к рибосоме.
|
|
|
Активация аминокислот . В синтезе белка участвуют активные аминокислоты. Активация аминокислот начинается с их взаимодействия с АТФ, в результате которого образуется макроэргический комплекс аминокислоты (Ак) с АМФ (аминоациладенилат - Ак~АМФ) и неорганический пирофосфат (ФФн):
Ак + АТФ→ Ак~АМФ + ФФн
Затем происходит взаимодействие активированной аминокислоты с соответствующей данной аминокислоте транспортной РНК (т-РНК) с образованием макроэргического комплекса аминокислоты с т-РНК (аминоацил~т-РНК):
Ак~АМФ + т-РНК → Ак~т-РНК + АМФ
Реакция катализируется ферментом аминоацил-т-РНК-синтетазой. Этот этап синтеза белка получил название рекогниции. .
Транспортные РНК представляют собой сравнительно небольшие молекулы, состоящие из 80-100 нуклеотидов. Каждой аминокислоте соответствует от одной до шести видов т-РНК, с которыми она может образовывать комплекс. Транспортные РНК имеют два специфических триплета. Один из них кодон, к которому присоединяется аминокислота, другой – антикодон, который может присоединяться к кодону соответствующей аминокислоты в и-РНК по принципу комплементарности. Роль т-РНК сводится не только к доставке аминокислот к местам синтеза белка – рибосомам, но и переводу информации с последовательности нуклеотидов на последовательность аминокислот.
Трансляция . Непосредственный синтез белка (трансляция) осуществляется на особых внутриклеточных образованиях, называемых рибосомами. Рибосомы построены из нуклеопротеинов, содержащих примерно 60% РНК и 40% различных белков. Они обеспечивают считывание генетической информации с и-РНК и реализацию ее в последовательности аминокислот в синтезируемой молекуле белка. Рибосомы обладают ферментативными свойствами, катализируя образование пептидных связей между аминокислотами. В процессе синтеза белка молекула и-РНК передвигается между двумя субъединицами рибосомы, к одной из которых присоединяется специфический белоксинтезирующий фермент (пептидилтрансфераза). В процессе этого перемещения кодоны и-РНК взаимодействуют с антикодонами т-РНК. При этом белоксинтезирующий фермент катализирует присоединение аминокислотного остатка т-РНК к полипептидной цепи. Образование и удлинение полипептидной цепи на рибосоме (элонгация) происходит с затратой энергии, источником которой является макроэргическое соединение гуанинтрифосфат (ГТФ).
|
|
|
Завершение синтеза белка (терминация) обеспечивается специальными кодонами в и-РНК (стоп-сигналами), которые не используются для кодирования аминокислот. Уже в процессе синтеза белка формируется первичная (последовательность аминокислот) и вторичная структура белковой молекулы. После завершения синтеза и отделения полипептидной цепи от рибосомы происходит формирование третичной и четвертичной структуры белка. В формировании третичной и четвертичной структуры белка участвуют дополнительные внутриклеточные органеллы (аппарат Гольджи).
Синтеза белка - энергоемкий процесс. Присоединение к полипептидной цепи одной аминокислоты требует затраты по меньшей мере пяти молекул АТФ. При активации аминокислоты АТФ распадается до АМФ, что эквивалентно затрате двух молекул АТФ. На этап трансляции затрачивается одна молекула ГТФ. В процессе элонгации расходуются две молекулы ГТФ на каждую присоединяемую к цепи аминокислоту. И, наконец, терминация (завершение синтеза) требует затраты еще одной молекулы ГТФ.
14. Качественные реакции на аминокислоты:
1. 1. Биуретовая реакция на белки и пептиды. Принцип: в щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет; окраска обусловлена образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка; биуретовую реакцию дают все белки, а также олигопептиды, содержащие не менее двух пептидных связей. Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка вносят 3 капли 10%-го раствора NaOH и 1 каплю 1%-го раствора CuSO4. Наблюдают образование сине-фиолетового окрашивания.
1. 2. Нингидриновая реакция. Принцип: при нагревании нингидрин образует с NH3, который выделяется при гидролизе из α -аминогрупп аминокислот, соединение сине-фиолетового цвета. Ход работы: к 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 5 капель раствора 0, 5%-го раствора нингидрина; помещают пробирку в кипящую водя-ную баню на 5 мин. Наблюдают за развитием розово-фиолетового окрашивания, переходящего со временем в сине-фиолетовое.
|
|
|
1. 3. Ксантопротеиновая реакция на ароматические аминокислоты (тирозин, фенилаланин, триптофан). Принцип: при нагревании с концентрированной азотной кислотой растворы белка дают желтое окрашивание; реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот.
Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 3 капли кон-центрированной HNO3 и нагревают (осторожно! ) в горячей водяной бане; появ-ляется осадок желтого цвета, пробирку охлаждают и добавляют 10 капель 10% NaOH – появляется оранжевое окрашивание.
1. 3. Реакция Адамкевича на триптофан. Принцип: триптофан в кислой среде вступает в реакцию с глиоксиловой кислотой (альдегидами), образуя при этом окрашенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации. Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 5 капель ледяной уксусной кислоты, которая всегда содержит небольшое количество глиоксиловой кислоты. Полученную смесь вначале нагревают 1-2 мин на водяной бане, затем охлаждают и по стенке пробирки осторожно, по каплям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 10 капель концентрированной серной кислоты. Помещают пробирку в кипящую водяную баню. Наблюдают образование красно-фиолетового кольца на границе раздела двух слоев.
1. 4. Реакция Фоля на цистеин. Принцип: цистеин, содержащий сульфгидрильную группу (-SH), при нагревании подвергается гидролизу с образованием сульфида свинца Nа2S. Ацетат свинца реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:
(CH3COO)2Pb + 2NaOH → Pb(ONa)2 + 2CH3COOH Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом дает черный (или бурый) осадок сульфида свинца: Na2S + Pb(ONa)2 + 2Н2О → PbS↓ + 4NaOH.
|
|
|
Ход работы. К 5 каплям раствора яичного белка добавляют 5 капель 30%-ного раствора NaOH и 1 каплю 5% -ного раствора (CH3COO)2Pb. Помещают в кипящую водяную баню на 2-3 мин. Наблюдают появление черного или бурого осадка.
15. Как доказать обратимость денатурации некоторых белков.
При обратимом осаждении мол-лы белка не подвергаются глубокой диссоциации, а оадки могут быть растворены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение осущ действием натриевых солей аммония, щелочных и щз металлов, спирта, ацетона. При необр-м осаждении происх глубокая денатурация белка, теряется гидрофильность. Белок не способен к восстановлению своих физико-хим свойств. Вызывается температурой, действ-м концентр минеральн кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидов.
Осаждение сернокислым аммонием-выпал осадок глобулинов, альбумины остались в растворе. Отфильтрованный осадок убрали. К фильтрату добавили порошок ск аммония-выпал осадок альбуминов. С конечным фильтратом провели биуретовую р-ю
Осаждение органическими раствортелями- спирт, ацетон, эфир вызывают дегидратацию белковых макромолекул, разруш-т водные оболочки, что пониж уст белка и выпадает осадок
Осаждение минеральными кислотами- вызывают резкую дегидротацию и нейтрализацию заряда, происх обр-е комплексных соединений-необ денатурация белка. Осадки растворяются в избытке серной и соляной кислоты.
Осаждение органическими кислотами-необратимо осаждают белки. Сульфосалициловая осаждает и белки и пептоны, трихлоруксусная-только белки.
Осаждение солями тяжелых металлов -соли меди, свинца, ртути, цинка, серебра. Обр комплексных нерастворимых в воде соединений. Соли тяж мет адсорбируясь на белковых мицеллах изменяют их электрический заряд. Нарушается вторичная и третичная стр белка. Разрывают дисульфидные связи.
16. Метод определения концентрации белков в плазме крови.
Исп. Понятия гипопротеинемия, гиперпротеинемия, нормопротеинемия.
Гипо-недост поступл белка пищи, нарушение бс белка, потеря при острых и хронических кровотечениях, лактация и посл месяцы беременности. Альбумины
Гипер-сгущение крови из-за потерь жидкости, инфекционных и токсичн поражениях. Глобулины
Биуретовый метод-осн на биуретовой реакции. В щелочной среде ионы меди обр с белками фиолет комплексы. Сод белка опр по интенсивности светопоглощения 540-560нм. Исп калибровочный график постр по стандартным р-рам белка. Измеряют на фотоколорметре.
17. Метод разделения белков и низкомолекулярных примесей.
Диализ-очищают от солей, сахаров и тд. В мешок из целлофана налили р-р белка и хлористым натрем. Мешок подвеш-т на стекл палочке в дист воду. Диализ протекает при комнатной темп. Через час из стакана с дист водой набирают 2 пробирки по 2 мл. В 1 проводят р-ю на ионы хлора-добавл азотн к-туи р-р азотнокисл серебра-выпадает белый осадок. Во аторой пробирке проводят биурет р-ю, если все проведено правильно – реакция отрицательная. Проводят до получения отрицательной реакции на ионы хлора, меняя воду в стакане.
|
|
|
18. Метод разделения белков по заряду.
Электрофорез-основан на движ белковых макромолекул в стационарном электр поле
Наличие заряда обусловлено налич-м функциональн групп радикалов ак остатков. ЗЧ перемещаются в поле к катоду или аноду в зависимости от их заряда. Проводят на носителе-бумаге-скорость миграции зависит от заряда, геле-см зависит от массы. Плазму крови можно поделить на + альбумины, а1 глобулины, а2 глобулины, в-глобулины, у-глобулины –
19. Метод разделения белков по молекулярному весу
Гель фильтрация на сефадексе-вариант колоночной хромотографии. основана на разделении белков по величине и форме молекулы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных гранулами пористого геля (сефадекса, агарозы), в буферном растворе с определенным значением рН. Гранулы геля проницаемы для белков благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром, размер которого зависит от типа геля (сефадекс G-25, G-200 и т. д. ). Смесь белков вносят в колонку и затем вымывают (элюируют) буферным раствором с определенным значением рН. Крупные молекулы белка не проникают в поры геля и перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Мелкие молекулы низкомолекулярной примеси (соли) или другого белка удерживаются гранулами геля и вымываются из колонки медленнее (рис. 1. 29). На выходе колонки раствор (элюат) собирают в виде отдельных фракций.
20. Как определить наличие в белке серосодержащих аминокислот.
Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. В метионине сера имеет прочное соединение, поэтому эту реакцию не дает. Реакция состоит в том, что при кипячении белка со щелочью цистеин или цистин легко отщепляют серу в виде сернистого натрия, который с плюмбитом дает черный или бурый осадок сернистого свинца. Интенсивность окраски зависит от количества в белке аминокислот цистина и цистеина и от концентрации белка в растворе.
Реакция Фоля на цистеин. Принцип: цистеин, содержащий сульфгидрильную группу (-SH), при нагревании подвергается гидролизу с образованием сульфида свинца Nа2S. Ацетат свинца реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:
(CH3COO)2Pb + 2NaOH → Pb(ONa)2 + 2CH3COOH Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом дает черный (или бурый) осадок сульфида свинца: Na2S + Pb(ONa)2 + 2Н2О → PbS↓ + 4NaOH.
Ход работы. К 5 каплям раствора яичного белка добавляют 5 капель 30%-ного раствора NaOH и 1 каплю 5% -ного раствора (CH3COO)2Pb. Помещают в кипящую водяную баню на 2-3 мин. Наблюдают появление черного или бурого осадка.
|
|
|
