 |
Николайчик. Геномика. Лекция № 2.
|
|
|
|
Лекция №1
Быстрое развитие геномики (родилась в 1995 вместе с первым отсеквенированным геномом) связано с совершенствованием технологии секвенирвония.
Методика Гилберта предполагала химическое расщепление цепочки нуклеиновых кислот, а методика Сэнгера предполагала ферментативную реакцию, но принцип более или менее совпадает.
В разработке метод химической деградации был наиболее дешевым, по эффективности они приблизительно соответствовали друг другу. Эти две методики позволяли определить до 150 п.о., но не более того (считан первый геном фага, но этот не организм - не считается).
Приемущество и недостатки этих методик:
М. химической деградации неэффективен, дорогостоящий (сейчас не используется совсем);
М. Сэнгера со временем была немного улучшена, на сегодняшний день позволяет детектировать чуть более 1000 н.п. (1300 - это абсолютный максимум, который она дает), и ограничения не на саму реакцию секвенирования, а на разрешающую способность полиакриламидных гелей.
Модификации, которые позволяют автоматизировать: Вместо радиоактивной метки на конец фрагмента помещается меченый дидезокситерминатор и в самом конце геля находится лазер, который сбоку освещает фрагменты, проходящие через него (детектор детектируют флюоресценцию и можно увидеть на графике).
Преимущество Сэнгера – этот метод был максимально автоматизирован (разработаны первые автоматические секвенирующие машины) и в принципе автоматизировано большинство стадий сиквенса в определении плазмидной ДНК, что естественно удешевили саму процедуру сиквенса и именно с помощью этой методики получена вся геномная информация, которая сейчас содержится в базе данных.
|
|
|
Однако метод пиросеквенирования за последние годы широко шагнул. В чем его преимущество: современные методики секвенирования используют нано-технологии, несмотря на то, что каждый сиквенс выдает 200, максимум 300 н.п., параллельно секвенатор гонит несколько сот таких сиквенсов.
Пиросеквенирование использует совсем другой подход определения нуклеот. последовательностей: так же в основе лежит синтез ДНК, т.е. так же работает полимераза, однако продукты реакции по-другому детектируются (как идет полимеризация ДНК, что является субстратом и продукты, это нужно посмотреть) образуется пирофосфат - 2 фосфатные группировки, которые связаны. При присоединении любого нуклеотида освобождается пирофосфатная группировка, и вся методика основана на детекции пирофосфата. Детектируется в ходе двухстадийной реакции: сначала фермент сульфурилаза из пирофосфата и аденозин-фосфо-сульфата собирает АТФ, затем этим АТФ активируется люцифераза и окисляет люциферин с выделением кванта света.
Испускается квант света в ходе этой реакции, т.е. если присоединен один нуклеотид – выделилась одна молекула пирофосфата, а на выходе мы имеем квант света, т.е. один нуклеотид - один квант света. На выходе пиросеквенатора нет диаграммы, о которой говорили ранее. А перосеквенатор детектирует кванты света (см. картинку). Идея заключается в следующем: если тот нуклеотид, который мы добавили, будет комплементарен матрице, то он будет присоединен и будет испускаться квант света, т.е. этот квант детектируется. И если несколько таких нуклеотидов подряд стоят, то они все присоединятся и будет соответствующее количество квантов света, затем идет отметка, смываются продукты реакции, добавляется следующий нуклеотид и идет фосфорилирование. Первичные пиросеквенаторы: реакция идет в пробирках, это было не очень эффективно, можно было прочитать несколько десятков нуклеотидов. Сейчас имеются коммерческие модели секвенаторов («Геномный секвенатор»). Их две модели: первая выдавала до 150 н.п., а вторая - до 300.
|
|
|
Современная процедура пиросеквенирования. 1 стадия - конструирование библиотеки ДНК, поскольку здесь задача получить несколько сот тысяч фрагментов (???????). Здесь к фрагментам присоединены адапторы, которые м.б. использованы в качестве матриц для дальнейшего секвенированиия. Сначала геномная ДНК дробится ультразвуком – получается набор фрагментов, добавляется адаптор к каждому из этих фрагментов, и затем к ним добавляются полистирольные шарики, на которых иммобилизованы праймеры. «Понятно, что» праймер будет комплементарен адаптору, адаптор прилипает к праймеру с определенным шариком. Мы получаем шарик, на котором закреплена матрица. Причем эта реакция делается таким образом, чтобы к одному шарику было прикреплено не более одной матричной цепи ДНК. Это идет таким образом, что значительная часть шариков окажется вообще ненагружена (их кильнуть), затем работа с теми шариками, которые нагружены матрицей. К каждому шарику добавляются стандартная смесь компонентов для ПЦР. Из каждого шарика делают своего рода микрореактор, т.е. добавляется масло, опять обработка ультразвуком, и получается такая суспензия, где в масле оказывается один полистирольный шарик. Следующая стадия процесса - эмульсионная ПЦР, где ПЦР идет в этих вот капсулах. В том случае, когда здесь появилась только одна матрица, в ходе такой ПЦР мы получаем множество копий одной и той же молекулы, прикрепленных к одному полистирольному шарику. Следующая стадия - разрушается эта капсула, денатурируется ДНК, остается только одна, т.е. мы получаем матрицу для секвенирующей реакции. У нас есть шарик, полностью нагруженный матрицами, которые к нему ковалентно присоединены праймером. Затем эти шарики насыпаются в микротитровальную планшетку. В ней ячейки, которые чуть-чуть превышают по диаметру шарик (200 тыс. шариков засыпается). Затем планшетки заполняются реагентами для секвенирования, планшетки в прибор, идет секвенир. реакция, и с каждой из матриц происходит одно и то же. У нас здесь праймер, который отражен с другой стороны, и ко всем идет присоединение одних и тех же нуклеотидов. Высокой чувствительности не надо, т.к. достаточное кол-во света испускается. С помощью сигнала получаем вон ту;) картинку секвенирования.
|
|
|
Немножечко истории.
Крэйг Вентер - успехи его только частично связаны с научной деятельностью, а большая заслуга как бизнесмена. В нач. 80-х появились секвенаторы. Американцы обсуждали такой проект, как геном человека. В 87 первая модель автоматического секвенатора, следовательно, можно было их использовать для генома человека. И в 89 - start генома чела.
Первый акцент был сделан на бактериальном геноме. В конце концов геном E. coli был определен только в 97-98 гг. (очень медленно, учитывая, что 40% уже к тому времени знали). Но вмешался Вентер. Его группа до этого занималась патологией мозга человека (выявляли гены, которые имеют отношение к патологии мозга). Вентер, чтобы ускорить все, предложил в начале 90-х метод ярлыковых экспрессируемых последовательностей - э то просто наши все фрагменты сиквенса кДНК. Идея Вентера: выделяем мРНК из интересующей нас ткани, делаем кДНК и секвенируем ее. «Тупо» подряд все клоны, которые получаются. Если получить достаточное количество этих сиквенсов, рано или поздно эти сиквенсы состыкуются др. с др. и мы получим полную последовательность мДНК. Даже если у нас нет полной ее последовательности, сиквенс соответствует тому гену, который экспрессируется (это ярлык о наличии такого гена и о том, что он экспрессируется конкретно в том образце, откуда мРНК была выделена). Он сгруппировал эти последовательности, посмотрел, каким генам они соответствуют, и получил информацию о том, какие гены экспрессируются в конкретной ткани. Смысл работа имеет, только когда много сиквенсов. И ВЕНТЕР предложил использовать это для генома человека.????
Предложил использовать shot-gun для сиквенирования генома человека. Раньше ребята конкретно парились (стандартный путь): делали геномные библиотеки, затем шла длительная фаза картирования, состыковать и получить набор минимально перекрывающихся клонов (выстроить клоны по длине генома, чтобы можно было затем секвенировать – энциклопедия генов), затем эти клоны размером несколько тысяч нуклеотидных пар разбивались на нормальные кусочки, чтобы его можно было нормально секвенировать… Процесс длительный, и самая трудоемкая стадия – картирование. Для эукариотического это бы вообще многие годы заняло.
|
|
|
Вентер предложил альтернативный подход, который использовался для небольших последовательностей ДНК. Допустим, если нужно определить последовательность плазмиды, мы 1) либо делаем рестрикционную карту, клонируем эти рестрикционные фрагменты и так же каждый из фрагментов секвенируем, 2) либо дробим ее мелкощепящей рестриктазой на фрагменты, получаем библиотеку небольших клонов, секвенируем каждый клон библиотеки, причем секвенируем достаточное количество клонов, чтобы несколько раз перекрывали всю последовательность плазмиды. Тогда высока вероятность, что, может, наберем (мы секвенируем одну букву один раз точно, а может, даже и больше). По статистическим особенностям использовать такой подход для крупных геномов не получается (можно лишь создать библиотеку, которая включает 99% генома, что сложно, долго, нереально).
Вентер предложил это для человека – собирать, что собирается, и стыковать, что стыкуется. Сделал упор на быстрое развитие компьютерной технологии. Обычно собирается 100-200 различных фрагментов, а затем уже стыковать эти относительно крупные геномные последовательности. Таким образом, мы отказываемся от трудоемкой стадии картирования, а усилия на заключительном этапе по закрытию всех дырок (стадия финиширования), как оказалось, куда меньше и быстрее. В общем удалось! И в 90-е Вентер попросил достаточно крупное финансирование на сиквенс генома H. inferstiaceae (возбудитель менингита). Был создан целый институт для геномного исследования (TIGR). Он закупил большое количество секвенаторов, и поскольку речь шла о сборке целого генома, закупились компьютеры для установки последовательности, а также приглашены программеры, которые писали первые для них программы (по стыковке сиквенсов и сборке геномной последовательности). За 8 месяцев определил всю геномную последовательность бактерии и в “Science” статейку. Там были и ошибки. Но все равно оказало колоссальное влияние на исследование генома человека.
Потом сиквенс еще одного микроорганизма (Mycoplasma genitalium?). Геном – полмиллиона н.п. длиной (короче, чем предыдущий), что представляет базовый набор, который определяет клеточную форму жизни. Сиквенс показал, что это совершенно другие организмы, – АРХЕИ.
|
|
|
Следующий этап на пути к геному человека - сиквенс эукариот. Первыми были дрожжи (без Вентера). По классической схеме. У дрожжей много хромосом (16): раздали по странам, там по лабам, а Лабы - по аспирантам (12 млн.н.п.).
Следующая стадия - сиквенс многоклеточных. 98 г. - НЕМАТОДЫ (100 млн.н.п.). Приблизительно тогда же сиквенс дрозофилы (Вентер), арабидопсиса. Вентер все делал быстрее. Следующей задачей его был сиквенс генома человека. В качестве модели дрозофила (180 млн.н.п.), а эухроматин составляет только 2/3 (уже меньше секвенировать), для дрозофил уже существовали генетические карты, 18% генома в базе данных. Создал компанию, основанную не на государственном финансировании, а на деньги венчурных капиталистов. В институте 300 секвенаторов, все автоматизировано, за раз 384 сиквенса.
Потом решил геном человека. Получаем ген – патентуем. Так думал отдавать деньги капиталистам, брал-то их в долг. Благодаря Вентеру к 2000 г. был закончен черновик генома человека (первый раз отсеквенировано менее 90% генома, а потом черновик). В итоге вышли одновременно 2 статьи: одна Вентера в “Science”, а другая, чуть раньше, – государственных академиков в “Nature” (это поставило крест на патентации генов Вентером).
Заслуги Вентера в том, что он ускорил развитие геномики и дал толчок к геномной революции – изменение подхода к решению биологических проблем – интегративный подход, от общего к частному, целостный (Ввел шот-ган метод, предложил исследовать сообщества м\о в Саргассовом море, культивировать которых еще не научились, путем простого ПЦР всего собранного материала – так можно посмотреть,какие гены вообще в сообществе присутствуют; создание искусственного микроорганизма с минимальным набором генов).
У ВЕНТЕРА много проектов: Сиквенс Саргассова моря, Синтез в пробирке функционального генома.
Вентер выиграл финансирование (частично государственное, частично коммерческое) проекта по созданию на основе Mycoplasma синтетической бактерии и уже создал компанию, которая называется Synthetic Genoms. В рамках этого проекта уже проделана некоторая работа (работа по инактивации генов Mycoplasma, Вентер уже опубликовал статью про синтез целого генома Mycoplasma в лабораторных условиях). Но полученный Вентером геном представляет собой не синтетический геном Mycoplasma genitalium, а геном Mycoplasma genitalium, в котором были прицельно внесены несколько замен генов. Внесение замен было необходимо для снятия этического вопроса о синтезе патогенного организма в лабораторных условиях. Специально были внесены замены, которые сделали организм непатогенным. В результате этого эксперимента было показано, что существует техническая возможность синтезировать из олигонуклеотидов путем последовательной стыковки друг с другом последовательность длинной 0,5 млн нуклеотидных пар. Полученный репликон был клонирован в E.coli. Следущая стадия данного проекта – это собрать все синтетические гены. Цель Вентера – это произвести минимальную бактерию, которая могла бы продуцировать топливо: водород, спирт (финансирует департамент энергии США).
Николайчик. Геномика. Лекция № 2.
|
|
|
