Конструирование геномных библиотек. 1 глава

Векторы, которые используются в геномных проектах. Используется большое количество плазмидных и фаговых векторов. У каждого носителя геномной ДНК есть свои плюсы и минусы. Поскольку библиотек всегда несколько, при их конструировании необходимо выбрать оптимальное сочетание векторов, которое обеспечит максимальную репрезентативность генома.

Плазмиды. рUC. 90% сиквенсов делается на этой плазмиде. В очень редких случаях берется какой-то другой вектор, но такого же типа – небольшая высококопийная бактериальная плазмида. Используется она, т.к. это высококопийная плазмида, присутствует в клетке до 1000 копий, ее легко выделить и концентрация ее в препарате высокая, поэтому легко очищать. Получается ДНК высокого качества,….. Т ехнологически такой вектор обеспечивает наивысшее качество сиквенса, поэтому основная масса секвенирования делается на таких плазмидах. К тому же процесс с использованием высококопийной плазмиды легко роботизировать. Недостатки, связанные с высокой копийностью:

a) Некоторые фрагменты геномной ДНК в принципе невозможно клонировать в таких плазмидах, т.к. даже нормальный клеточный ген, если число его копий многократно возрастает, может оказаться токсичным для клетки. Эукариотические гены тоже могут быть токсичными для бактериальной клетки. 5-10% генома в таком векторе клонировать нельзя из-за проблемы токсичности.

b) В такие векторы нельзя клонировать протяженные фрагменты ДНК длиной больше нескольких т.н.п. Когда в pUC делаются вставки по 20-30 т.н.п., плазмиды становятся нестабильными, т.к. копийность у плазмиды та же самая, около 50% ДНК в клетке может оказаться плазмидной. Возникает мощное селективное давление, чтобы уменьшить количество ДНК. Постоянно идут процессы рекомбинации, достаточно легко может происходить реорганизация, в первую очередь делеции и инверсии. Любая перестройка плазмиды в сторону уменьшения будет подхвачена естественным отбором. Относительно стабильными оказываются вставки размером не более 1,5-2 т.н.п.

Фаговые векторы. У них всегда больше емкость: если инсерционный вектор, емкость около 10? т.н.п., если вектор замещения фага лямбда – 20? т.н.п. К тому же при размножении бактериофага не стоит вопрос токсичности, т.к. при размножении фага клетка погибает в любом случае, а фаг реплицировать и упаковать свою ДНК успеет. Это единственная причина, по которой фаговые векторы до сих пор используются в геномных проектах. За исключением очень экзотических ситуаций у клонированных в фаговом векторе генов не имеется шанса воспрепятствовать размножению фага, и если выбирать правильные штаммы фагов, то проблем с перестройками меньше. Считается, что фаговые векторы замещения достаточно стабильны, и их до сих пор используют в крупных геномных проектах, когда нужно закрыть пробелы, которые никак не клонируются в других библиотеках.Недостатки: ДНК фага выделять гораздо менее удобно (сложнее методика, гораздо более трудоемко, автоматизировать сложнее). Поэтому фаговые векторы обычно используются на стадии финиширования, когда нужно закрыть пробелы.

Следующий по емкости – космидный вектор. Это гибрид плазмиды и бактериофага. Картинка неправильная: должно быть 2 cos-сайта. До начала 90-х это были векторы с максимальной емкостью (увеличена по сравнению с бактериофагом в 2 раза). Размер космиды: 53 т.н.п. (максимум, который помещается в головку фага лямбда) минус размер самого вектора – это 45-51 т.н.п. емкости. Нормальная космида несет 2 cos-сайта, т.к. фаг нормально пакует в головку линейную ДНК между двумя cos-сайтами. Приготовление космидной библиотеки – гораздо более трудоемкая методика, но такие библиотеки считаются библиотеками хорошего качества, поскольку если получен высокий титр фаговых частиц, то ДНК не надо реамплифицировать, библиотека стабильна и долго хранится. В любой момент можно инфицировать такими космидами бактериальные клетки и получить соответствующие гены.

Следующие по времени разработки векторы – это дрожжевые искусственные хромосомы. Эти векторы специально разработаны под проект «Геном человека». Эта программа официально стартовала в конце 90-х. Первая стадия проекта заключалась в разработке векторов. Специально под проект разрабатывались векторы с максимальной емкостью, которую можно было представить, на основе механизма сегрегации и репликации дрожжевых хромосом. Они были разработаны, на них были построены библиотеки. Е мкость стандартного дрожжевого вектора – порядка 600 т.н.п., а мега-YAC – 1.4 миллиарда. Т.е. можно получить 6-7 тыс. клонов, и это будет весь геном человека. Поработали с ними лет 5, получили библиотеки, и где-то в середине 90-х выяснилось, что эти дрожжевые клоны с крупными вставками очень нестабильны. ДНК плохо хранится, ее нужно поддерживать в дрожжах, а тогда возникает та же ситуация, что и с крупными вставками в плазмидах бактерий, только в гораздо более суровом варианте: множественные внутренние реорганизации, делеции, транслокации и т.д.С таким трудом прокартированнные библиотеки, привязанные к физическим картам, оказались ни на что не годными, поскольку это уже не та ДНК, которая была в исходном геноме человека.

Дрожжевые искусственные хромосомы используются до сих пор, но с учетом этих вещей. Они используются для многих специализированных методов исследования генома, поскольку они все равно имеют свое значение. Если нужен крупный фрагмент ДНК, его особо никуда не клонируешь. Дрожжевые искусственные хромосомы – линейный фрагмент ДНК, который должен нести 3 составных части. Как правило, такая дрожжевая хромосома имеет точку инициации репликации плазмид, для того чтобы нарабатывать ДНК в бактериях. Препарат сначала амплифицируется в бактериях, получают большое количество плазмидной ДНК, а потом приготавливаются плечи искусственной хромосомы. В обязательном порядке в вектор должны входить 3 селективных маркера (обозначены буквами X, Y и Z). Два из них должны быть в одном плече хромосомы, еще один – в другом. Плазмида линеаризуется: обычно какой-то фрагмент ДНК вставлен между теломерными участками, он вырезается одной рестриктазой, и получается линейная хромосома. Мини-хромосома – несколько т.н.п., реально такая структура могла бы реплицироваться в дрожжевых клетках, но есть какой-то минимальный размер, меньше которого они оказываются нестабильны. YAC меньше 100 т.н.п. не поддерживаются. Затем такая маленькая линейная хромосома режется рестриктазой, сайт для которой располагается в пределах одного из маркеров, в данном случае – маркера Z. В результате мы получаем 2 плеча хромосомы. На одном плече – теломера и 1 селективный маркер, на втором плече – центромера, второй селективный маркер и теломера. Затем геномная ДНК режется той же рестриктазой, это частичная рестрикция, фрагменты отбираются по размеру и лигируются с плечами хромосомы.

Продукты лигирования вводятся в дрожжевые сферопласты, это достаточно сложная и не очень эффективная методика. Затем эти дрожжи регенерируют клеточную стенку и высеваются на селективную среду. Селективная среда должна отбирать хромосомы, которые несут 2 маркера и, как правило, содержит индикатор на отсутствие разрезанного маркера. Это достаточно эффективная методика. Получается библиотека, достаточно высокий выход этих клонов. Плечи могут лигироваться друг с другом, но такие хромосомы без вставки ДНК нестабильны. Методика достаточно простая, космидную библиотеку сделать сложнее. Когда выяснилось, что эти искусственные хромосомы нестабильны, разрабатывались альтернативные векторы, и сейчас 2 типа таких векторов широко используются, на них делаются все библиотеки для геномных проектов.

Секвенируются бактериальные искусственные хромосомы. Это достаточно громко звучит, но фактически это м ини-производные от плазмиды Е. coli – F-фактора. О т него остается точка инициации репликации и система распределения плазмиды по дочерним клеткам. F-плазмида нестабильна, число копий поддерживается в клетке на том же уровне, что и число копий бактериальных хромосом. В медленно растущих клетках будет всегда 1 копия F-плазмиды, в быстрорастущих – чуть больше. При такой низкой копийности должна быть система распределения по дочерним клеткам. Это относительно небольшая плазмида, векторов таких достаточно много, все они отличаются дополнительными сайтами, вставленными в плазмиду. Обычно сайт антибиотикорезистентности и обычно достаточно сложная система клонирования используется.

Должны быть сайты, в которые могут встраиваться интересующие фрагменты, и они стандартно находятся посреди lacZ -гена. BAC веткора стабильны со вставками до 300 т.н.п., а реально работа обычно идет со вставками 130-150 т.н.п. Не всегда имеет смысл до предела догонять емкость.

Еще один вектор такого же плана – это искусственные хромосомы на основе фага Р1. Это крупный фаг, более 100 т.н.п. В клетке он существует в виде плазмиды, не встраиваясь в хромосому. Может быть лизогенным. Это природная плазмида, рассчитанная на подержание достаточно крупного репликона.

На основе фага Р1 разработаны два типа векторов. Первый – эквивалент векторов на основе фага лямбда: есть векторы замещения, есть векторы типа космид, которые используют систему упаковки фага Р1. Объем этих векторов ограничен емкостью головки фага, порядка 125 т.н.п. Этот вектор сохраняет преимущества вектора на основе фага лямбда и имеет еще большую емкость. На основании этого фага разработан и второй вектор – Р1-искусственные хромосомы (PAC). Емкость такая же, как и у BAC, – стабильны со вставками до 300 т.н.п. Библиотеки, построенные на фаговых и бактериальных искусственных хромосомах, будут различаться по своим свойствам, поэтому в геномных проектах используют и те, и другие.

Картирование геномов.

Без хромосомных карт нормальный геномный проект сделать невозможно. Есть три основных подхода к картированию: генетическое, физическое и цитологическое. В основе всех методик генетического картирования лежит изменение (определение?) частоты рекомбинации между двумя маркерами. Несмотря на то, что это самый первый из придуманных подходов к картированию, он используется до сих пор. Сейчас в геномных проектах большее значение имеют методики физического картирования, в которых расстояние между локусами на хромосоме измеряется физическими методами. Генетическое картирование не позволяет измерить реальное расстояние между маркерами на хромосоме, физическое – позволяет. Классическое цитологическое картирование – это карты политенных хромосом дрозофилы, которые строились просто за счет прокрашивания хромосом слюнных желез. В дрозофильном геномном проекте карты политенных хромосом использовались.

В классическом представлении генетическое картирование использует гены в качестве локусов, причем в данном контексте под маркером подразумевается маркер, который имеет фенотипическое проявление. Естественно, что для любого организма не так много локусов, которые можно связать с определенным фенотипом, и даже из тех локусов, к которым какой-то фенотип привязан, не всеми можно пользоваться. Для стандартного эукариотического генома число локусов, которые имеют фенотипическое выражение и которые можно использовать в генетическом картировании, редко превышает пару тысяч – в этом недостаток классического генетического картирования в случае эукариот. Около 10% можно использовать. Необходимо было разработать а льтернативные маркеры, которые можно было бы использовать вместо генов, и поэтому в последние несколько десятков лет появился целый набор бактериальных маркеров, которые можно «ковырять» в любом количестве и привязывать к любому месту хромосомы. Детектируются они в молекулярном виде. Три типа геномного полиморфизма, которые возможны и которые сейчас используются в качестве молекулярных маркеров:

- полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphism);

- полиморфизм длин простых повторов (Simple Sequence Length Polymorphism);

- полиморфизм по одиночным нуклеотидам (Single Nucleotide Polymorphism).

Полиморфизм – это аллели конкретного участка ДНК. Как правило, это либо нуклеотидная замена, либо небольшая инсерция или делеция. Т.е. то же самое, что и в случае аллелей генов классических, характерно и для молекулярных маркеров. Они работают, когда в соответствующем месте генома есть различные аллели. Такие молекулярные маркеры можно использовать при картировании.

Самый простой вариант - использование длин рестрикционных фрагменто в, с ним сталкиваемся каждый раз при проведении рестрикции плазмидной ДНК. На схеме показаны 2 варианта одного и того же локуса: один из них несет дополнительный рестрикционный сайт, второй – не несет. Это и есть полиморфизм. Как их можно регистрировать? Обрабатывается соответствующей рестриктазой геномная ДНК, если сайт присутствует, то у нас получается на 1 фрагмент больше, чем когда сайта нет. Классическое рестрикционное картирование: находите 2 полиморфных локуса и располагаете их друг относительно друга, и получается рестрикционная карта генома. Выясняете, в какой точке располагается рестрикционный сайт, потом сравниваете размеры фрагментов. Для небольшого участка это делать достаточно легко. Если плазмида около 10 т.н.п., это легко сделать, если около 30 – фактически невозможно. В случае геномного картирования получается, что рестриктазы режут гораздо чаще, чем надо бы, и получается очень много фрагментов, соотнести их друг с другом нереально. Поэтому используются различные модификации карти-рования, которые, как правило, связаны с тем, что прицельно выбирается какой-то фрагмент генома и рестрикция идет только в этом участке. Тогда это можно детектировать и проанализировать. Классический подход в работе с полиморфизмом – это гибридизация по Саузерну (это скорее для облегчения анализа рестрикционных фрагментов – например, если анализируются большие фрагменты ДНК, которые дают на форезе шлейф, тогда зонд может выделить на шлейфе соответствующие бэнды). Если у нас есть какой- то полиморфный локус, делается ДНК-зонд – фрагмент ДНК, который перекрывает этот локус. Затем выделяется геномная ДНК, режется полностью соответствующей рестриктазой. После рестрикции идет электрофорез и с агарозного геля фрагменты ДНК переносятся на мембрану капроновую, после чего гибридизуется с ДНК-зондом, и в тех местах, где гибридизация произошла, на радиоавтографе видны полоски. Если полиморфного локуса нет, то зонд будет гибридизоваться с одним фрагментом, если есть – с обоими. Методика длительная и трудоемкая, поэтому сейчас не используется. Сейчас гораздо чаще используется ПЦР, т.к. это проще, дешевле, быстрее и автоматизировано. Детекция полиморфизма с помощью ПЦР: принцип тот же. Нужно выделить локальный фрагмент вокруг полиморфного локуса. В случае ПЦР он выделяется при помощи праймера: один праймер слева, второй справа. Продукт ПЦР потом обрабатывается рестриктазой, если сайта нет, получается один фрагмент, если есть – 2.

Полиморфизм длин простых повторов (слайд). Их есть 2 типа: минисателлиты и микросателлиты. Микросателлиты – повтор 2 или 4 н.п. Это ошибки в работе ДНК-полимеразы. Когда есть участок, где много раз повторяется олигонуклеотид, есть вероятность проскальзывания ДНК-полимеразы. Она с определенной долей вероятности может диссоциировать с матрицей и присоединиться к соседнему повтору, при этом образуется петля. В результате при репликации будет либо на один повтор больше, либо на один меньше. Такое проскальзывание, когда уже есть несколько повторов, происходит с достаточно высокой вероятностью. Полиморфизм такого типа встречается достаточно часто. С минисателлитами (это повторы до 25 н.п.) не совсем понятно, каким образом они генерируются. Как очень маловероятная версия – так же проскальзывание. В геномах эукариот присутствуют и минисателлиты, и микросателлиты. Чаще используют микросателлиты. Детектировать их можно по-разному. Те же самые методики – и гибридизация, и ПЦР – удобны (смотрят по длинне фрагментов, амплифицируюя область с SSLP). Эти молекулярные методики позволяют работать с диплоидными геномами. Если геном гетерозиготен, то выявится присутствие обоих аллелей. Если правильно подобраны условия электрофореза (обычно полиакрил-амидный электрофорез), можно разделить фрагменты, которые даже на 1 нуклеотид различаются по размеру. Обычно различаются минимум на 2 а в случае минисателлитов – на несколько десятков нуклеотидных пар.

Полиморфизм по одиночным нуклеотидам. Детектировать его такими методами нельзя. Самым надежным методом детекции является секвенирование соответствующего участка ДНК.

До недавнего времени это было совершенно нереально. Первая методика основана на том, что вы знаете позицию полиморфного локуса и вы прицельно стараетесь детектировать известные аллели. Принцип детекции основан на гибридизации короткого олигонуклеотида, который перекрывает область. Если олигонуклеотид достаточно короткий и тщательно подобран, наличие одной неспаренной пары оснований может воспрепятствовать его гибридизации с матрицей. Гибридизация сильно зависит от условий, и можно подобрать жесткие условия, когда только 100%-комплементарный нуклеотид будет гибридизоваться. Но надо еще детектировать гибридизацию. Один из методов детекции связан с использованием флуоресцентной метки, пришитой на один конец такого олигонуклеотида, причем на второй конец этого олигонуклеотида пришит тушитель флуоресценции. Праймер сделан таким образом, что концы, которые прилегают к метке и тушителю флуоресценции, комплементарны друг другу. Это так называемый молекулярный бакен. Если олигонуклеотид гибридизуется, а гибридизоваться он будет в случае отсутствия полиморфного локуса, то флуорофор и гаситель будут разнесены в пространстве и при облучении светом соответствующей длины будет флуоресценция. Если гибридизации нет, то флуоресценции не будет. Этот метод пригоден для десятков, максимум сотен полиморфизмов, которые имеют подходящую последовательность.

Есть технология, которая позволяет детектировать тысячи и десятки тысяч таких полиморфизмов. Это так называемая технология ДНК-чипов, или микромассивов, как их по-другому называют. Это фрагменты ДНК, зафиксированные на стеклянной подложке, с которыми можно проводить гибридизацию. Как правило, на стеклянной подложке фиксируются немеченые фрагменты, но можно фиксировать и меченые. Есть два типа таких микрочипов,

а) один из них достаточно просто делается. На стеклянную подложку сначала наносятся микроскопические капельки, под каждый ген делаются зонды, какая-то часть гена амплифицируется, потом эти кусочки ДНК капаются на стеклянную подложку, специальным образом фиксируются, денатурируются и получается одноцепочечный зонд, который соответствует определенному гену.

б) В случае детекции полиморфизма по одиночным нуклеотидам используется другой вариант таких микрочипов, в которых зонд на стеклянной подложке фиксируется прямо в процессе его синтеза. Синтез идет по методу фотолитографии, суть которого заключается в том, что включение следующего нуклеотида в растущий олигонуклеотид контролируется получением предыдущего нуклеотида лазером. В синтезе олигонуклеотидов участвуют две группировки: донорная и акцепторная. Для того чтобы контролировать этот процесс, на каждом шагу амидные группы сначала активируются, что позволяет присоединить один нуклеотид, а с другой стороны группы блокируются, т.е. следующий уже не присоединится. Поэтому процесс идет циклически: добавили 1 нуклеотид, он может присоединиться только в одном месте, затем промываете, избыток удаляете, деблокируете концевую группировку, тогда может присоединиться следующий нуклеотид. Стандартные синтезаторы используют химические процессы блокировки/деблокировки, а можно это делать при помощи света. Компания …. разработала микрочипы, в которых деблокировка идет за счет облучения. В компьютер, который этот процесс контролирует, вносится программа, какая последовательность должна быть, и сначала первый нуклеотид фиксируется на подложке, а затем в соответствии с тем, какой нуклеотид должен быть присоединен, лазерный луч облучает какие-то определенные участки подложки. Там, где произошло облучение, деблокирована активная группа, затем подается нужный нуклеотид, и он будет присоединяться только там, где светил лазер. Потом отмываются неприсоединенные нуклеотиды. Т аким образом можно синтезировать зонды из нескольких десятков нуклеотидов. За счет того, что все контролируется лазером, можно получить очень плотные чипы. На один чип помещают тысяч 400 таких олигонуклеотидов. Р еальное число зондов, которое можно использовать, получается около 100 000, потому что каждый из них должен быть как минимум в 3-х повторностях, а лучше – в четырех. Плюс еще на каждый чип необходимо наносить негативный контроль (процентов 10 чипа). Такая технология используется для детекции полиморфизма. Хромосомную ДНК режут рестриктазой на мелкие куски и метят флуоресцентной меткой. Добавляется на зонд меченая ДНК и идет гибридизация в условиях, которые жестко подобраны под размер нуклеотидов. Если меченая ДНК гибридизовалась с соответствующим олигонуклеотидом, то флуоресцентную метку можно детектировать методом конфокальной микроскопии. Когда полиморфизм детектирован, есть подходы к локализации.

Как можно картировать маркеры? Способы:

1. Молекулярные маркеры точно так же, как и классические гены, можно картировать генетически. Точно так же вы ставите скрещивание и определяете частоту рекомбинации, но просто вы смотрите не на фенотип, а детектируете наличие соответствующего маркера у потомков, выделяя ДНК и ставя, допустим, ПЦР (детектируется наличие локуса). Различия при фенотипическом и при молекулярно-биологическом генетическом картировании имеются.

- При использовании молекулярных маркеров генетическое картирование получается чуть более трудоемким, но зато это можно делать быстрее. В классическом генетическом картировании нужно ждать F₂ или делать анализирующее скрещивание (если родители чистые линии?).

- При использовании молекулярных маркеров все равно, какие гены рецессивные, какие доминантные, главное, чтобы они были разными у скрещиваемых организмов. В этом большое преимущество молекулярно-биологического картирования, поскольку возможны случаи кодоми-нантности, неполной доминантности, что будет значительно усложнять детекцию.

- Генетическое картирование проводить достаточно просто, но у него есть недостатки. Это ограниченная разрешающая способность. Только у модельных организмов можно достичь высокой разрешающей способности, да и то у E. coli – порядка 3 т.н.п., у дрозофилы и дрожжей – порядка 10 т.н.п.

- Вторая проблема – непрямое измерение расстояния между локусами. Возможны ошибки, которые связаны с аномалиями рекомбинации. В геноме любого организма есть горячие точки рекомбинации, есть локусы, в которых рекомбинация может быть заблокирована, в результате могут получаться в некоторых случаях неточные карты. По большей части это не проблема, но иногда локусы на генетических картах могут быть переставлены местами. При генетическом картировании с определенной вероятностью такие штуки происходят всегда. Физическое картирование тоже может давать ошибки, но генетическое картирование в этом плане менее точно. Поэтому генетическое картирование используется для модельных организмов, которых давно изучали генетически. Генетические карты внесли существенный вклад в геномные проекты, но, тем не менее, если сейчас генетической карты нет, ее уже никто и не строит, сейчас сразу делается физическая карта, потому что она считается в целом точнее и все равно потом нужна будет. На завершающих стадиях без физической карты будет сложно.

2. Есть масса методик физического картирования, но мы остановимся на трех. Наиболее старый вариант физического картирования – это рестрикционное картирование. Помимо него используются еще 2 методики. СТС-картирование – очень удобный подход, который осуществляет картирование параллельно с отбором клонов для последующего секвенирования. И такая методика, как флуоресцентная гибридизация на препаратах, она же FISH (i n s itu), – что-то среднее между физическим картированием и цитологическим. Потому что такая методика хороша, когда идет привязка к карте хромосомной, полученной методами цитологического окрашивания.

Лекция 4.

Физическое картирование: как его можно модифицировать.

1) Использование редкощепящих рестриктаз: в лаборатории на факультете это NusI?1:10000 нукл.пар для генома человека. Распознает ГЦ- последовательность из 8 нуклеотидов. Редкая встречаемость. У бактерий 15-20 таких сайтов на геном. У эукариот еще реже: 15-20 на хромосому.

2) Каждая группа организмов характеризуется разным ГЦ-составом. Зная особенности используемого объекта, можно выбрать такую рестриктазу, чтобы сайты для нее встречались именно в данном геноме реже. Напр., Xba1, стандартная, режет по гексануклеотидной последовательности, которая очень редко встречается в геноме эукариот.

Нужно не только разделить геном на относительно крупные фрагменты, но и определить их размер. Для определения длины полученных кусков есть несколько подходов. В классическом понимании при картировании - гель-электропорация, и ее модификации. Позволяет разделять эти килобазные фрагменты.

Для генома млекопитающих характерна редкая встречаемость в геноме динуклеотида СG в связи с особенностями работы системы репарации. Цитозин часто метилирован, и при его дезаминировании получается тимин. Это довольно частое явление. В случае, когда цитозин не метилирован, из него при дезаминировании получается урацил. Его распознают и удалят. А тимин остается, т.к. это стандартное основание. Из-за метилирования у млекопитающих б о льшая часть СG-пар со временемменяется на TG. А остаются СG-пары в только промоторных областях. Это СpG-острова, с аномально высоким содержанием СG-пар. Считается, что эти области выполняют регуляторную функцию, способствуя активации транскрипции. Sma1 – 1 сайт на 78 000 нуклеотидных пар по геному человека. В норме – 4 096 (4 в 6^ой степени) оснований. 200 млн нукл. пар в среднем на 1 хромосому в геноме человека.

Итак, получили фрагменты по 10 – 20 млн. нукл. пар. Более 10 000 в относительно низкоконцентрированных гелях. Разделяются фрагменты по 15-20 тыс.. Если уменьшить концентрацию агарозы до 0,3% (это минимум, после которого агароза уже не гель), то разделяется до 50 000 нукл. пар. То есть 50 000 – предельная разрешающая способность стандартного агарозного геля. Модификации электрофореза: изменение направления и интенсивности тока. Слайд: форез в ортогональном пульсирующем поле. Есть несколько модификаций пульс-электрофореза, они принципиально ничем не отличаются. Ток попеременно подается то на одну пару электродов (A на слайде), то на другую (B). При подаче тока в 1 направлении крупные фрагменты застревают в геле. Когда направление напряжения меняется, ДНК «выдергивается» из геля и продолжает движение в другом напавдлении. В результате при правильном подборе условий ДНК движется зигзагом, медленно, но верно. Раделение так более эффективное. Этим способом можно разделить фрагменты генома размером до 10 млн. нукл. пар., как куски плазмиды маленького размера – в стандартном геле. То есть, нужно правильно подобрать рестриктазы и использовать специализированные методики. Просто построить рестрикционную карту генома недостаточно. С помощью такой мотодики можно расположить на карте определенные локусы. Такие методы отрабатываются вначале в силу простоты исполнения на бактериальных геномах. Пример: бактериальный транспозон Tn5 (широко используется) содержит сайты рестрикции для Nus1. Стандартная ситуация: проводится направленный мутагенез фагом Tn5, отбираются мутанты по определенным генам с четко дефективным фенотипом. По фенотипу понятно, какой ген дефективен в каждом из мутантов. Кстати, дополнительно этим способом можно выяснить точную локализацию гена, в котором произошла мутация. Далее проводится рестрикция Nus1, и в участке, где появились дополнительные сайты рестрикции (то есть где встроился фаг), и произошла мутация. Так к рестрикционной карте можно привязать локусы некоторых генов. С небольшими модификациями тот же принцип используется и для картирования геномов эукариот.

В целом методика электрофореза трудоемкая и имеет свои ограничения. Одна из альтернатив электрофорезу – оптическое картирование. Есть несколько вариантов такого оптического карт-я. В целом принцип – это визуализация разрывов ДНК с использованием люминесцентных микроскопов. ДНК связывается с флюоресцентным интеркалирующим красителем и облучается ультрафиолетом и просто визуализируется под микроскопом. При этом надо иметь возможность видеть, где именно произошел разрыв. Поскольку в растворе ДНК представляет собой неупорядоченный клубок, для проведения оптического картирования нужно распрямить ДНК до линейной формы. Можно двумя способами:

1) агарозный гель при застывании меняет свою структуру. Если смешать ДНК с расплавленной агарозой, то при застывании агарозы ДНК будет менять конфигурацию в соответствии с образующимися порами геля. Клубок ДНК распрямляется, вытягивается и, более того, структура подвеграется определенному напряжению. При достаточно большом разрешении микроскопа в поле зрения будут попадать почти линейные участки ДНК. Как правило, стандартный стеклянный слайд содержит иммобилизованную рестриктазу, наверх капается раствор ДНК в рестрикционном буфере, в котором отсутствуют ионы магния. Все рестриктазы требуют дивалентных катионов, наилучший из них для рестрикции – магний. То есть, в отсутствии магния рестрикция не идет. Капля застывает, агароза полимеризуется, ДНК распрямляется, приобретает топологическое напряжение. Далее капли обрабатывают ионами магния и начинается рестрикция. При этом из-за напряжения в молекуле ДНК разрезанные концы немного разъезжаются. Затем идет обработка красителем и визуализация под микроскопом. Под микроскопом видно, в каких участках молекулы произошла рестрикция.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: