Конструирование геномных библиотек. 6 глава

Это простой транспозон, по концам которого есть инвертированные концевые повторы. Тип такой же, как у кукурузы. Есть и по-другому устроенные транспозоны. Например, у элементов B имеются длинные инвертированные повторы. По структуре он соответствует составному прокариотическому транспозону. В геноме дрозофилы значительная часть мобильных элементов имеет совсем другую структуру: прямые повторы на концах. Это нетипично для классических составных транспозонов. Это уже ретротранспозоны. P-элементы дрозофилы: наиболее изученные у дрозофилы. Были обнаружены на классических генетических экспериментах при исследовании явления так называемого гибридного дисгенеза. Суть явления: в зависимости от того, какой из родителей несет P-элемент, получается различный эффект на потомство. Если P-элемент у самца, то гибриды стерильны, когда у самки - фертильный. Стерильность гибрида связана с очень активным перемещением транспозона у потомков скрещивания во время развития генеративных клеток. При реципрокном скрещивании такого перемещения транспозона не происходит. Мобильный генетический элемент кодирует, помимо транспозазы, еще и репрессор транспозиции. СЛАЙД: структура элемента. Этот элемент дает достаточно длинный транскрипт с одного промотора, который способен дать начало двум разным белкам. Рамка считывания одна, несколько – экзонов (недочет слайда). В результате альтернативной процессии может образоваться либо полноразмерный белок, и это будет транспозаза, либо укороченный белок. Он будет репрессировать транспозицию. По какому пути пойдет процессинг – зависит от того, в каких клетках происходят эти процессы. В соматических клетках репрессор достаточно эффективно процессируется, в генеративных клетках репрессор практически не синтезируется. В генеративных клетках синтезируется в основном транспозаза, а репрессора нет. Ситуация, когда одна и та же цепь ДНК кодирует 2 белка: и репрессор, и транспозазу, - достаточно стандартная. У бактерий такая ситуация есть, многие транспозонгы кодируют свои транспозазы и репрессор, и почти всегда репрессор – просто дефектный вариант транспозазы. Он связывается с теми же самыми концами транспозона, но не может осуществить транспозицию. Происходит экранирование сайтов связывания функциональной транспозазы. Механизм дисгенеза: сперматозоид практически не несет цитоплазмы, а яйцеклетка богата цитоплазмой, именно в цитоплазме рецептор и располагается. СЛАЙД. Если материнская клетка содержит ген, который кодирует P-элемент, в этой клетке будет присутствовать достаточно большое количество репрессора. Репрессор сохраняется у всего следующего поколения. Эта молекула (репрессор) очень стабильна и присутствует во всех клетках дочернего организма. Соответственно репрессор будет и в генеративных клетках, хотя там он и не синтезируется. То есть он будет присутствовать, потому что он есть еще у матери. Его количество оказывается достаточным, чтобы блокировать перемещение транспозона. Если Р-элемент находится в мужском организме, то потомок не получает ни одной молекулы репрессора, и затем в генеративных клетках с началом экспрессии Р-элемента ничто не препятствует его перемещению. Он активно скачет, и в результате зародыш получается дефектным из-за перемещений Р-элемента. Копий Р-элемента немного, а репрессор синтезируется достаточно эфективно. Достаточно одной молекулы репрессора, чтобы она связалась с каждой их этих копий. Таким образом, видно, что у эукариот есть транспозоны, похожие на бактериальные. Свои нюансы накладываются тем, что гены прерывистые, экспрессия идет немного по-другому. Есть дополнительные возможности для регуляции. Эукариоты имеют еще и другой класс мобильных элементов, ретротранспозоны. Их также 2 типа, принципиально различающихся. Общее между ними то, что они перемещаются с использованием РНК в качестве промежуточного продукта транспозиции. Сначала транскрипция, затем обязательно обратная транскрипция, вследствие этого мобильный элемент должен кодировать обратную транскриптазу. Это общее между классами. Самый простой для понимания механизм перемещения ретротранспозонов касается класса тех ретротранспозонов, которые сродни ретровирусам. Что из чего произошло – непонятно. Либо ретротранспозон упрощенная версия ретровируса, либо ретровирус – усложненная форма ретротранспозона. Скорей первое. Есть ретровирусы с геномом, представленным ДНК. Им для встраивания тоже нужна РНК-стадия. Чаще всего их геном пакуется в клетке в белки капсида, и эта вирусная частица обеспечивает инфекцию следующей клетки. Транспозон отличается от ретровируса тем, что нет внеклеточной стадии. Транспозон не пакуется, способен перемещаться только внутри определенной клетки и для переноса его в другую клетку должны быть особые условия. СЛАЙД геном ретровирусов. Основной признак, по которому выделяют этот класс ретротранспозонов, - наличие прямых повторов по концам Тн. Эти повторы полностью идентичны. Внутренняя часть ретровирусов представлена тремя генами. Это «условные» гены, так как транскрибируется вся матричная РНК вместе. Затем идет трансляция, причем как правило этот процесс эффективен для первого гена, а для транскрипции последующих генов нужен сдвиг рамки считывания или супрессия стоп-кодона = трансляционная супрессия. Как правило, происходит первое. Эти гены транслируются с эффективностью порядка 5% от трансляции первого белка. Именно первый ген кодирует обратную транскриптазу. Env-ген кодирует белки оболочки. Gag-ген что-то еще кодирует. Эти гены – тоже достаточно условная штука, продукт трансляции подвергается протеолизу. Одиночные белки капсида – результат расщепления первичного транслята на отдельные участки. Перемещение таких ретровирусов: СЛАЙД как организованы разные производные ретровирусов. На слайде – стандартный ретровирус. Большая часть ретротранспозонов – это всего лишь делеционные варианты ретровирусов. Классический пример – Ty-элемент (transposon yeast) дрожжей. Несет на концах длинные повторы, то есть Long Terminal Repeats (LTR). По историческим причинам они называются дельта-элемент дрожжевых транспозонов. Внутри две рамки: TyA – это gag-ген, TyВ – это pol-ген. Env-ген отсутствует. Интегразы, видимо, тоже нет. Четко выделяется две рамки считывания. Одна соответствует gag-гену, другая - pol-гену. Еще один элемент дрозофилы, copia, тоже содержит вроде бы одну рамку считывания, но она несет гомологию с этими двумя генами. С pol-геном – в любом случае. Ну а больше ничего и не нужно, поскольку именно она кодирует обратную транскриптазу. Еще один класс транспозонов отличается: уже нет прямых повторов, но есть обратная транскриптаза. СЛАЙД. Механизм ретротранспозиции: обратная транскриптаза на своем собственном транскрипте обеспечивает сначала синтез небольшого фрагмента, близкого к начальному повтору, используя транспортную РНК в качестве затравки. РНК отжигается рядом с левым инвертированным повтором. Идет сначала обратная транскрипция этого повтора. Так как обратная транскриптаза обладает и РНК-азной активностью, так называемая РНК-аза Н (эйч). Она же обеспечивает небольшое подъедание вот этого конца, части этого повтора. Получаем кДНК, выступающую с той стороны. Это позволяет осуществить процедуру смены матриц. Подъедание некритично. Транскрипт может отсоединиться и гибридизоваться с левым концом, потому что это повторы, и они комплементарны. Диссоциация идет не очень эффективно. Поэтому активность РНК-азы Н критична в данном случае. Образуется двунитевой участок, спаривается с другим концом и выступает в качестве затравки для дальнейшего синтеза ДНК. После смены матриц мы получаем целиком полный транскрипт. СЛАЙД. Синтез следующей цепи начинается с РНКазной активности: расщепляет первичный транскрипт. Расщепление идет неполное, остаются какие-то фрагменты от матричной РНК, они используются в качестве затравки для второй цепи ДНК. Потом синтезируется до конца часть этой второй цепочки, потому что начало ее может быть несинтезировано. Ведь праймеры были случайные фрагменты – итог действия РНКазы Н. Чтобы произошла репликация начала, опять должна произойти смена матриц. Недосинтезированная матрица должна присоединиться к другой матрице, досинтезированной, хоть к той же самой цепи. Тогда она досинтезируется до конца. Но затравка остается. С этой затравки «-»цепь дореплицируется до конца. В результате имеем полностью завершенную двухцепочечную структуру ретровируса с полными копиями концевых повторов. Это весь ретровирусный транспозон. Потом эта структура должна встроиться в геномную ДНК, а механизм перемещения сходен с консервативной транспозицией. Продукт гена интеграза обеспечивает ту же функцию, что и транспозаза прокариот. По структуре интегразная часть входит в состав другого белка как домен. Как и транспозаза, она образует ступенчатые концы, они встраиваются в сайты-мишени, затем идет дупликация концов в сайте-мишени. Так встраивается ретровирус. Но такого типа ретровирусы могут захватывать какие-то клеточные гены в состав своей ДНК. СЛАЙД: показывает,что Ty-элемент имеет структуру такого же типа, даже способен образовывать псевдовирусные частицы. Еще один тип ретровирусов: с полиА-элементами. Они же - элементы без длинных концевых повторов, или LINE-элементы (long interspersed nuclear elеment). Это название исторически сложилось:были обнаружены как сателлитная ДНК, то есть большое количество копий в геноме. И потом выяснилось, что это транспозоны. В состав этого транспозона входит обязательно ген обратной транскриптазы, она имеет и РНКзную активность. Обязательна еще эндонуклеазная функция. Выполняет ее отдельный домен транскриптазы. То есть для перемещения этого элемента достаточно одной рамки считывания. В LINE-элементах всегда есть вторая рамка считывания. Непосредсственно для перемещения она не нужна. Еще нужен полиА-хвост, без него не переместится. Механизм транспозиции: полиА хвост гибридизуется скакой-то последовательностью в геноме мишени несколько Т подряд. Эндонуклеаза распознает эту структуру и обеспечивает однонитевой разрез, разрыв в одной цепочке Получается затравочный конец, 3прим-ОН. Синтезируется кДНК. Все это осуществляется одним белком. Потом идет синтез 2^ой цепи и интеграция в хромосому. Детали этого процесса не совсем понятны. Должен быть сделан второй надрез и встраивание досинтезированной цепи. По одной модели: надрез делается в самом начале, а фермент держит концы вместе. Потом все интегрирует. Другая модель: делается надрез, идет синтез матрицы, потом второй надрез, фермент при перемещении держит концы РНК и ДНК вместе. По окончании синтеза – процессы репарации: застройка брешей и замена РНК на ДНК. Структура стабилизируется после лигирования. Репарация может происходить и после лигирования. Ретротранспозоны гораздо более эффективны в плане транспозиции, чем ДНК-транспозоны.

ТРАНСПОЗОНЫ (ПРОДОЛЖЕНИЕ).

Обратная транскриптаза очень часто отваливается раньше времени, и у таких делеционных производные конец будет реплицироваться, а начало ретровирусного генома не будет реплицировано. Такие транспозоны потом уже не перемещаются, потому что у них нету промотора своего собственного, они не транскрибируются, и соответственно нет мРНК, она не мигрирует в цитоплазму, и вообще они не являются субстратом для транспозиции. А если бы даже и являлись, если каким-то образом дефектный транспозон попадает под активный промотор, он всё равно не кодирует функциональной обратной транскриптазы, т. е. этого белка нету, он не свяжется с дефектной копией, и не будет идти транспозиция. С небольшой вероятностью обратная транскриптаза может связаться не со своей матрицей, но это не очень эффективный процесс. В случае ДНК-транспозонов (слайд показывает ситуацию) понятно что для перемещения должна идти транскрипция, транскрибируется ген транспозазы, мРНК попадает в цитоплазму, идёт трансляция, транспозаза синтезируется, но мишень для транспозазы она в ядре находится т. е. транспозаза независимо от своей мишени попадает в ядро где естественно может связаться уже с любыми инвертированными повторами, не только с инвертированными повторами интактного транспозона, но и с дефектными. И чем ближе эти повторы друг к другу, чем больше делеции тем более эффективным будет перемещение. Слайд показывает принципиальную разницу. Именно по этой причине ретротранспозоны эукариотических геномов более эффективны, как LINE-элементы, так и ретровирусоподобные. Эта ситуация особенно характерна для LINE-элементов.

Слайд показывает один интересный факт. За значительную часть псевдогенов в эукариотических геномах (за их появление) отвечают ретротранспозоны (это и LINE-элементы и ретровирусы тоже могут этим заниматься, но в принципе любой МГЭ, который кодирует обратную транскриптазу, может обеспечивать формирование псевдогенов). С LINE-элементами получается проще, потому что в принципе в зависимости от того, куда встроился этот LINE-элемент при его транскрипции может захватываться соседний ген, особенно когда это дефектный LINE-элемент. Есть ещё такое явление как LINE-трансдукция, т. е. при обратной транскрипции с очень небольшой эффективностью захватывается соседний участок генома. Естественно, что потом полученный транскрипт процессируется, из него вырезаются интроны и в новое место встраивается кДНК копия (не содержит интронов). Как правило, не содержит одного из конца генов также, т.е. трансдуцированный ген получается дефектным. Таким образом, получается достаточно много псевдогенов. Этот механизм генерирования псевдогенов в некоторых геномах оказывается достаточно эффективным. В частности, если говорить о хлебных дрожжах, Sacharomyces cerevisiae – у них достаточно нетипичный для эукариот геном. Нетипичность заключается в том, что в кодирующей последовательности генов практически нет интронов, только 5 генов хлебных дрожжей имеют интроны, причём все они располагаются в некодирующей части, в самом начале гена. Считается, что в какой-то момент такой механизм генерирования псевдогенов привёл к удалению интронов из генома дрожжей. По каким-то причинам в этом довольно компактном геноме эволюционно выгодно иметь прцессированные псевдогены, но он естественно может экспрессироваться, если подстраивается под промотор. В геноме хлебных дрожжей эти процессы шли достаточно эффективно и привели к практически полному удалению интронов. Для сравнения – пивные дрожжи – у них всё нормально, интроны разбросаны по всем генам.

Ещё один класс мобильных генетических элементов, наиболее эффективный у нас с вами в геноме представлен SINE-элементами. Аббревиатура похожа на LINE, только здсь S - shot. Сходство по названию имеет еще функцмональное значение, оно также подчёркивает тот факт, что SINE-элементы используют механизм транспозиции LINE-элементов. Это не значит, что SINE-элемент - это делеционное производное LINE-элемента, как правило, различные SINE-элементы происходят от коротких ядерных РНК, транскрибируемых РНК-полимеразой-III (третьей, потому что у нее промотор внутри гена). Соответственно, это какие-то модифицированные, мутантные версии этих генов. Они каким-то образом распознаются обратной транскриптазой INE-элементов. Это, наверное, немножко противоречит слайдам в соответствии с которыми SINE-элемент должен распознаваться только своей собственной матрицей но с определенной вероятностью идёт распознавание и чужой матрицы, в частности, вот таких модифицированных версий малых ядерных РНК. И естественно, такое распознавание приводит к перемещению этих малых ядерных РНК. Такие SINE-элементы в геномах различных организмов будут иметь различное происхождение. В частности у нас с вами наиболее эффективный SINE-элемент, которого1,5 млн копий в геноме называется Alu (это название рестриктазы Alu-1, которой резалась одна фракция сателлитной ДНК). Оказалось что есть сайт для этой рестриктазы в SINE-элементе, поэтому если сателлитную ДНК резать этой рестриктазой, то получаются фиксированного размера фрагменты в огромном количестве, которые из разных частей генома происходят.

Структура Alu- последовательности: левые и правые части имеют гомологию с тем siРНК ядерной. Эта РНК есть в любом ядре, однако у других организмов SINE-элементы как правило от других малых ядерных РНК происходят. Фактически эит части, каждая из них это повтор этой РНК. Между ними располагаются полиА последовательности, но в принцие, это, наверное, тандемная дупликация одной и той же РНК, только вот эта часть значительно укорочена и не функционирует при транспозиции, функциональной оказывается вот эта. Размер Alu-элемента в среднем около 290 н.п. Различные копии немножко варьируют по своему составу. Каким образом стандартная малая ядерная РНК стала распознаваться ферментами, которые LINE-элемент кодирует не совсем понятно, но чётко экспериментально показано, что LINE-элемент, один-единственный, который в геноме человека активен, L1 он необходим для перемещения Alu-элемента, если его выключить, то и Alu не скачут (это всё на клеточных линиях показано). Геном человека немного необычен, т.к. у нас всего один-единственный SINE-элемент есть, но зато он очень сильно распрыгался по геному. У мышей их 4, приблизительно равномерно представленных и их суммарное количество - примерно как и в геноме человека. ДНК - транспозоны очень неэффективны, в геноме человека они вымерли давным-давно. Всего около 3% генома занимают ДНК-транспозоны. Ни один из них не является активным, это реликты. В б о льшей части транспозонов уже трудно найти какие-то сайты транспозазы, но тем не менее определенное сходство нуклеотидных последовательностей с известными транспозонами есть, поэтому эти 3% фиксируются как бывшие транспозоны. Ретровирусоподобных ретротранспозонов сейчас ни одного активного в геноме человека нет, но относительно недавно в нашем геноме эти звери прыгали и напрыгали на 8% и присутствуют в числе копий около 450 000. LINE-элементы, наиболее эффективные представители мобильных генетических элементов у нас с вами в геноме, и один из них чётко показан функционально. Может ещё какие-то есть. Показать перемещения мобильных генетических элементов в человеческом геноме сложно, т.к. работа идёт на клеточных линиях. Чисто экспериментально процедура достаточно сложная и во многом содержит элемент везения. SINE-элемент - это у нас фактически только Alu-последовательность. Более 30% генома занимает класс транспозонов, которые используют механизм перемещения, основанный на действии эндонуклеазы и обратной транскриптазы. Все цифры очень приблизительны, т.к. это уже неактивные МГЭ и какую-то их часть, которая уже сильно видоизменена, мы уже не зафиксируем. В связи с тем, что такой огромный процент генома занимают МГЭ, может возникнуть вопрос: а что они там делают? Никто это вам точно не скажет. Как-то так получилось, что геном эукариот очень толерантен к увеличению размера и на эволюционном уровне это, скорее всего, компенсируется теми преимуществами, которые большое количество областей гомологии в геноме создают для рекомбинационной эволюции. Слайд иллюстрирует возможные перестройки в геноме, которые могут быть обусловлены рекомбинациями между идентичными копиями транспозонов, разбросанных по всему геному. Поскольку все эти мобильные генетические элементы, особенно в тот момент, когда они впервые инфицируют геном, очень интенсивно перемещаются по всему геному, их очень много и они достаточно протяженные - LINE-элемент стандартный порядка 7 000. За счёт этого могут происходить совершенно разные события, в зависимости от того, как эти повторы расположены. Допустим, рассмотрим хромосому, в которой 2 транспозона в одинаковой ориентации располагаются. За счёт рекомбинации между этими повторами происходит делеция части между ними. Если повторы инвертированы, произойдёт инверсия. Если повторы располагаются на различных хромосомах, могут происходить рекомбинации между копиями одного и того же транспозона, которые в разных местах расположены. В результате мы получаем транслокацию одной хромосомы на другую, а во второй хромосоме происходит делеция. И все эти процессы достаточно легко происходят и во многих случаях они не имеют негативного эффекта на функционирование генома. Но это всё приводит и к дефектам во время мейоза. Как правило, такие перестройки сопровождаются ещё и диплоидизацией или анеуплоидизацией, когда идёт дупликация. Потому что при появлении такой перестройки, когда идёт следующий мейоз, с такими хромосомами нормальные не могут сегрегировать. Поэтому выживают только те гаметы, в которых произойдёт ещё одна абберация, т.е. произойдёт нерасхождение и в результате они смогут спариться нормально в уже дуплицированные хромосомы. И эти вещи не очень часто происходят, хотя сама рекомбинация происходит с достаточно высокой частотой. Допустим, на бактериях, где нет таких ограничений, поскольку у них нет мейоза, вы можете легко наблюдать такие вещи. Я сталкивался с не очень удобными штуками. Транспозон TNT. У него по концам 2 повтора по 1 500 н.п. (Загадочный рисунок). Если он встроен в геном, то он встроен в строго определённой ориентации. Если вы захотите вдруг определить ориентацию такого транспозона, то у вас возникнут проблемы. Самый простой вариант – это поставить ПЦР. Допустим, вы знаете, в каком локусе он встроен. Вы берёте 2 праймера – один вот здесь и второй праймер к началу гена кономицинрезистентности. Но поскольку 2 альтернативных варианта – такая ориентация и ориентация совершенно противоположная, вы берёте ещё вот этот праймер. Но результаты с этими праймерами будут совершенно одинаковыми. Между IS-элементами будет происходить рекомбинация. Когда выделяете ДНК из бактериальных клеток, где их миллиард, то… Когда я пытался оценить какой процент клеток с перевёрнутой версией транспозона, получилось около 0,1%. Очень высокий. Эти процессы инверсии идут даже при относительно небольшой гомологии – 1,5 т.п.н. Когда я работал с мини-транспозонами, там по 20 нуклеотидных пар на концах – это считается, что за пределами того расстояния, которое распознаёт recA белок, который инициирует гомологичную рекомбинацию, всё равно с очень низкой вероятностью они переворачиваются, всё равно идёт рекомбинация, но там уже частоты порядка 10-8.(это степень). Даже коротенькие – пара десятков нуклеотидов. А у эукариот пара десятков нуклеотидов отлично рекомбинируется. У дрожжей очень эффективно идёт рекомбинация именно с короткими областями гомологии. Сами процессы рекомбинации идут с высокой частотой, они могут фиксироваться в геноме, когда на такую перестройку накладывается еще абберация в процессе мейоза. При межвидовых скрещиваниях тоже очень часто такие штуки фиксируются. Там ещё дополнительный прессинг на диплоидизацию.

Структура центромерных и теломерных частей хромосомы. Без них невозможно нормальное поддержание и нормальная репликация линейных хромосом. Наверное, у половины прокариотических организмов геном линейный. И в подавляющем большинстве у них несколько хромосом. Спирохеты все линейные, агробактерии имеют две хромосомы, и одна из них линейная, есть организмы прокариотические с четырьмя хромосомами. Так что это всеобщее заблуждение, что геном прокариот – одна кольцевая хромосома.

Центромеры в классическом представлении у прокариот нет, а теломеры есть во всех случаях, когда геном линейный. Только у хлебных дрожжей структура центромеры точно известна. Единственный эукариотический геном, у которого центромера очень коротенькая – менее 100 н.п., поэтому точно известна её структура. Это АТ-богатая последовательность, а по концам её консервативные участки – один, второй и третий. Каждый из них выполняет свою функцию. (Слайд). Центормера – это область прикрепления микротрубочек веретена деления. В случае дрожжевых центромер чётко показывается, какие белки где связываются. Один мультимер белка связывается с центральной областью, различные белки связываются с левой и правой областью, получается такой изогнутый комплекс, к которому прикрепляются микротрубочки. Суть любой центромеры в том же и заключается – чтобы прикрепить аппарат деления, однако их, как правило, не удаётся минимизировать до сотни нуклеотидов. Минимальный размер центромер, который в большинстве геномов детектируется, измеряется, как правило, десятками тысяч н. пар, а есть организмы, у которых таких фиксированных центромер нет вообще, а микротрубоки крепятся по всей длине хромосомы. Область ДНК, которая входит в центромеру имеет определённую структуру. Помимо тех компонентов, которые нужны для аппарата деления, в центромеру обычно напихивается достаточно большое количество МГЭ и всякой прочей балластной ДНК, поэтому есть какое-то эволюциооное давление на увеличение размера центромеры. Дрожжам как-то удалось справиться, а большинство организмов не может.

Теломера (слайд) это абсолютно необходимая структура линейной хромосомы. Кольцевую хромосому удобно реплицировать – одна репликативная вилка может проехать по кругу несколько раз, и это приведёт к репликации хромосомы. Репликация: лидирующая цепь – с точки origin начали и поехали до самого конца, а запаздывающая цепь должна реинициироваться за счёт фрагментов Оказаки через опредеденное количество нуклеотидов. Для эукариот это расстояние около 100 – 200 н.п. На лидирующей цепи копия матрицы синтезируется легко до конца, а запаздывющую цепь завершить клетка не может, потому что фрагменты Оказаки прикрепить некуда. В результате остается 100-150 нуклеотидов недореплицироавано. Соответственно, клетка должна иметь какой-то механизм репликации этого конца, либо при делении эта часть будет утрачиваться, и хромосома будет укорачиваться с каждым делением. Этого не происходит нигде, кроме как в соматических клетках человека. Теломеры у большинства организмов представлены различными коротенькими простыми повторами (Слайд). Эукариоты и прокариоты используют разный механизм репликации теломерных концов. У прокариот эти концы, как правило, ковалентно замкнуты стандартной сахарофосфатной связью. На конце получается небольшая петля, и при такой организации проблем в с репликацией нет. Потом можно включить стандартный механизм репарации, который вместе с полимеразой-1 достроит небольшую брешь. Почему эукариоты не используют такой механизм – неизвестно. Теломера – это несколько тысяч повторов, причём на одной из нитей всё-таки остается одноцепочечный участок, который в принципе невозможно никак реплицировать. Он защищен путём образования кольцевой структуры – Т-петли, которая образуется за счёт того, что этот однонитевой участок вытесняет гомологичный повтор, с такой петельной структурой связывается белковый комплекс, как минимум 2 белка, который стабилизирует структуру и защищает однонитевой участок. Такая теломерная структура достаточно стабильна. У различных организмов вариации есть, но, как правило, свободного линейного конца нет и быть не может, потому что это субстрат для действия нуклеаз. Аппарат, который обеспечивает дорепликацию теломер, имеет непосредственное отношение к ретротранспозонам, поскольку теломераза – это обратная транскриптаза с чётко прослеживающейся гомологией с ретровирусными ферментами. Эукариоты пошли по пути, отличному от прокариотического. Прокариоты пытаются реплицировать теломеры, эукариоты не пытаются стандартной клеточной репликацией реплицировать теломеру, она каждый раз укорачивается, и специальная ферментная система затем наращивает коротенькие повторы. Теломераза работает т.о., что поддерживается стабильная длина этих повторов. Если теломера сильно укоротилась, теломераза активируется и больше этих повторов добавляет, если теломера длинная, то теломераза не активируется. Теломераза – один из многих рибонуклеопротеидов в клетке, которые помимо белковой части имеют ещё небольшую РНК в составе. Эта молкула РНК выступает в качестве матрицы для достройки теломерных повторов. (Слайд). мРНК спаривается с теломерным повтором, поскольку это комплиментарная последовательность, в результате у нас есть затравочный 3`конец, теломераза использует его и за счёт обратно-транскриптазной активности достраивает 1 повтор теломерный. Затем двигается дальше, идёт достройка повтора, когда он достроен, теломераза перемещается к следующему повтору. Этот процесс повторяется многократно. В результате получается интересная ситуация: теломераза не достраивает ту нить, которую нужно достраивать, она достраивает другую нить, удлиняется цепь, которая и так длиннее. Здесь смысл есть: когда длина одноцепочечного участка достаточна, здесь может быть инициирован фрагмент Оказаки. В тех случаях, когда этот фермент не работает, с каждым клеточным делением теломеры укорачиваются, изаканчивается это тем, что уже не теломеры укорачиваются, а хромосомная последовательность, что приводит клетку к катастрофе. Когда такое укорачивание затронет существенные для жизнедеятельности клетки гены, клетка либо погибнет, либо может претерпевать раковое перерождение. По этой причине соматические клетки человека невозможно поддерживать в культуре.

ПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ ГЕНОМЫ

Есть существенное отличие между прокариотами и эукариотами. Прокариоты гораздо более разнообразны и гораздо более мобильны. Мобильность не надо путать с эволюционной изменчивостью, потому что за счёт прерывистости генов эукариоты обеспечивают гораздо более высокую рекомбинационную изменчивость, прокариоты этого сделать не могут, потому что у них гены непрерывные. Зато у них есть механизм, который обеспечивает достаточно быструю приспособляемость, связанный с горизонтальным переносом генов, межвидовым, что абсолютно исключено у большинства эукариот. Такая мобильность эукариотического генома создаёт сильные проблемы для попыток систематизировать эти организмы. Вся классификация, которую вам дают на микробиологии, она выеденного яйца не стоит, потому что нету такого понятия, как бактериальный вид. Есть огромный пул прокариотических генов, в котором гены достаточно свободно перемещаются между видами. Поэтому говорить о том, что есть какой-то бактериальный вид, не приходится. Это просто какая-то удобная концепция человеческая, а в реальной природе есть какое-то сообщество прокариотических организмов, в котором относительно свободно перемещаются гены в соответствии с потребностями, которые перед этими организмами стоят.