Конструирование геномных библиотек. 7 глава

О геноме информацию можно представлять в целом ряде форматов и говорить достаточно сложно о том, что из себя геном представляет, потому что слишком много данных можно об этом геноме предложить для вашего усвоения. Вы просто должны иметь общее представление о размере бактериального генома, о том количестве генов, которые в нём присутствуют. Когда мы говорим о генах, мы в первую очередь говорим о генах, кодирующих белок, потому что гены бывают и не кодирующие белок. Это отдельный класс, есть различные регуляторные гены, рРНК гены, тРНК гены. Только те гены, которые белок кодируют, дают представление о сложности организма, о сложности его молекулярной биологии. И должно быть у вас представление, какой % балластной ДНК, в первую очередь – МГЭ.

На сегодняшний день количество бактериальных геномов с известной нуклеотидной последовательностью превысило 1000. Все их анализировать смысла нет, потому что общая картина начала складываться лет 10 назад, когда количество изученных геномов измерялось одним десятком. Но всё время появляются интересные геномы, и о некоторых придётся изложить более подробную информацию. Заключения об общей организации генома можно представить в графической форме. Статьи, которые выходят о геноме, в обязательном порядке содержат такой график, это такая неписанная договорённость. Как правило, различные функциональные участки генома помечаются каким-то цветом. Функциональные участки: гены, транспозоны, гены рРНК, гены тРНК. И общие характеристики генома, такие, как ГЦ-состав, которые очень варьируют, как правило, по геному. (Слайд). Геном представляют таким образом, чтобы точка начала репликации, т.е. цифра 1 – это один из нуклеотидов, с которых начинается репликация. И соответственно, с другой стороны генома будет точка завершения репликации. Для большинства геномов в той или иной степени выражена закономерность: гены располагаются не произвольным образом по геному, а в зависимости от того, в какой части хромосомы они расположены, они будут считываться либо с одной цепи, либо с другой. (Загадочный рисунок). Поскольку репликаза – достаточно крупный мультибелковый комплекс, достаточно много белков должны координировано работать, и когда идёт репликация, то естественно, что никакой другой белок в эту область доступ получить не может. РНК-полимераза – тоже крупный мультибелковый комплекс, который тоже претендует на эксклюзивное владение участком ДНК, с которым он работает. Т. е. транскрипция и репликация белка – это вещи взаимоисключающиеся. Если представить ситуацию, когда транскрипция идёт в одну сторону, а репликация - в другую. Получается, что один из комплексов должен диссоциировать и отсоединиться от матрицы, чтобы либо тот, либо другой процессы были завершены. Диссоциировать, конечно, должна РНК-полимераза, потому, что ДНК-полимераза - это очень процессивный фермент, который не должен останавливаться, по крайней мере, пока не будет повреждении ДНК, которое потребует репарации. Она не останавливается, она выкидывает к чёртовой матери РНК-полимеразу и это накладывает ограничения на транскрипцию. Если транскрипция идёт в другую сторону, никаких проблем нет. Репликаза быстрее движется, она догоняет РНК-полимеразу, РНК-полимераза просто заканчивает транскрипцию, отсоединяется и не начинает следующий цикл транскрипции, пока не пройдёт репликативный комплекс. В зависимости, от того, как организованы эти ферменты, эта проблема выражена более или менее ярко, поэтому в различных геномах будет по-разному выражена интенсивность этих процессов. В некоторых геномах почти одинаковое количество генов на двух противоположных цепях, но абсолютно одинакового количества никогда нет. Всегда есть предпочтения. В одной половине хромосомы (её ещё реплихорой называют) гены преимущественно располагаются на одной цепочке, в другой половине - на противоположной. В связи с такой организацией, поскольку кодирующая последовательность располагается на одной цепи, а некодирующая – на другой, есть ещё один интересный показатель, так называемый ГЦ-перекос. Определяется по формуле: (Г -Ц)/(Г+Ц). Это просто отражение нуклеотидного состава, процента ГЦ-пар на двух комплиментарных цепях. Если полностью случайная последовательность ДНК, то это соотношение, как правило, равно 0. Если оно не случайное, то будет наблюдаться ГЦ-перекос либо в одну сторону, либо в другую. В какую сторону – сказать сложно, это зависит от кодонового состава. Неслучайный состав будет в кодирующей последовательности. Когда гены располагются на одной цепочке, перекос будет в одну сторону, когда на другой – в другую. Точку старта, инициации и терминации репликации как раз определяют по ГЦ- перекосу. Прочие количественные показатели можете потом сами почитать. Некоторые графики могут показывать расположение МГЭ, некоторые – расположение тРНК, рРНК. Сам ГЦ-состав генома – очень важная характеристика. Для прокариот очень интенсивно идут процессы горизонтального переноса. ГЦ-состав генома организма – это величина постоянная, которая связана с тем, каким образом идут в основном репарационные процессы, в зависимости, от того, какая система репарации более эффективна. Репарация всегда вносит небольшую асимметричность в содержание различных оснований в геноме. Затем, после того, как такая асимметричность уже возникает, уже видоизменяются ферменты, поскольку от этого показателя сильно зависят процессы, которые связаны с метаболизмом ДНК, поскольку требуется всегда плавление 2-цепочечной структуры, чем больше ГЦ-пар, тем с большим трудом идёт плавление. Сложнее инициировать транскрипцию и репликацию, соответственно должны быть модифицированы ферменты, которые за эти процессы отвечают. И наоборот – когда меньше ГЦ-пар это протекает значительно проще. Но АТ-богатый геном тоже невыгоден – поцелому ряду причин: и менее стабильна такая структура и т. д. В идеале должна быть золотая середина, но такого никогда нет, геном всегда или чуть-чуть АТ-богатый, или чуть-чуть ГЦ-богатый, бывают экстремальные случаи. У малярийного плазмодия геном на 81% состоит из АТ-пар, у стрептомицетов под 70% ГЦ-пар. Если в геном попадает чужеродная ДНК за счёт горизонтального переноса, то там процент ГЦ-пар будет другой. (Считать надо, конечно, не на десятках н.п., а на тысячах). Если посмотреть, как по геному варьируют разные участки, можно очень четко увидеть фрагменты генома чужеродного, которые за счет горизонтального переноса сравнительно недавно попали в этот геном. (Слайд). Бывают и мелкие участки – это либо МГЭ, либо кодирующие белок гены, принесенные за счёт горизонтального переноса, но уже закрепились, и идёт их фиксация, адаптация и выравнивание ГЦ-состава. А крупные участки – это, как правило, бактериофаги, почти всегда умеренные бактериофаги, которые какое-то время сидят в геноме, могут из него иногда вырезаться, но с течением времени они там закрепляются и остаются надолго.

Лекция 11.

Бактериальные геномы.

Геном бактерии Deinococcus radiodurans, интересна история её открытия. Снабжение солдат продуктами всегда сопряжено с проблемами, значитальная часть армейских запасов – консервы. Вдруг в 50-х годах стали взрываться консервы, ядерные исследования, физики предложили простериализовать. А через некоторое время стали взрываться и эти простериализованные банки, позвали биологов - те проверили, оказалось, что в банках живёт эта самая бактерия, которая выдерживает любое повреждающее ДНК воздействие, и целый ряд прочих физико-химических воздействий - высушивание, вакуум. Возникли спекуляции на тему того, что это имена та «спора жизни», бактерия, прилетевшая к нам из космоса.

Геном этой бактерии довольно давно определён. В этом геноме содержаться все известные гены, отвечающие за репарационные процессы, причём значительная их часть повторена несколько раз (Rec-гены). В геноме D einococcus есть система репарации двухцепочечных разрывов, что нетипично для бактерий. Хромосомы у них, как правило, в нескольких копиях в клетки поддерживается. Геном – 4 репликона различного размера, самый большой из них 2,6 млн н.п., второй 400 000 н.п., эти два репликона называются хромосомами, есть ещё два репликона, которые называются плазмидами. Различия между хромосомами и плазмидами довольно условные, но считается, что если убрать репликон и клетки и клетка живёт, то это плазмида, если убрать невозможно - хромосома. Значительная часть генов репарации в самом большом репликоне. Deinococcus входит в одну группу с Thermus, значительная часть другой хромосомы досталась ему от Thermus, скорее всего один из репликонов за счёт горизонтального переноса был перенесен. Понятно, что были реорганизации, большая часть генов мигрировала на большую из хромосом, потому как у них различные системы репликации. У одной из хромосом система репликации, как у E.coli, у меньшей из хромосом система репликации плазмидного типа, есть par- гены. Но здесь находятся жизненно важные функции. Высокое содержание ГЦ-пар.

Thermotaga maritima – ещё одна бактерия, которая достаточно рано секвенировали геном, термофильная бактерия, большой спектр ферментов, отвечающих за метаболизм различных полисахаридов, так был интерес биотехнологов изучить эту бактерию, как потенциального продуцента термостабильных ферментов. Правда биотехнологии не используют её, но выяснились интересные особенности генома. Нормальная среда обитания этой бактерии – это глубоководные горячие источники, дно океана бедно организмами, нет света, первичной продукции. Жизнь сосредоточена возле подводных вулканов – можно использовать источники энергии, идёт хемолитотрофных синтез, фиксируется углерод. Возникает экологическая ниша, первичные продуценты, какие-то животные. Достаточно токсическая среда, сера, сероводород, в основном там обитают Археи. Около четверти генома имеют высокую гомологию с Археями. Пример достаточно эффективного горизонтального переноса между различными надцарствами. Иллюстрация того, что прокариотическая организация не накладывает никаких ограничений, позволяет свободно мигрировать генетической информации.

16% генов гомологии с Архебактериями, менее 2 млн н.п. свободноживущий организм.

Aquifex aeolicus - cамый маленький – абсолютно минимальный геном – хемолитоавтотроф. 1.5 млн н.п. 1,5 генов. 93% кодирующей ДНК.

Enterobacteriaceae в целом гораздно интереснее, чем экзотические организмы по той причине, что их легче культивировать, изучать. Обитают при плотности популяции 10 -10 в ЖКТ, за счёт скученности обмен генетической информацией тоже активно идёт, можно отчетливо проследить. Базовая часть хромосомы, нашпигованная МГЭ. Несколько интегрированных геномов бактериофагов. Штамм К12 имеет 7 лизогенных, часть являются реликтовыми и вырезаться не могут. Острова патогенности связаны с различными факторами вирулентности, они добавляются к основному геному блоками. Например, система секреции третьего типа – весь секреторный аппарат плюс несколько эффекторов находится в пределах такого острова. Некоторые могут нести несколько систем секреции третьего типа, как правило, первая секреторная система обеспечивает проникновение энтеропатогена через клетки кишечного эпителия, вторая нужна уже для его фиксации в макрофагах, например Yersinia. Поскольку клетки разные, нужны различные эффекторы для проникновения. Значительная часть факторов вирулентности может находиться на плазмидах. Например синтез энтеротоксина, гены адгезинов, гемолизины, колицины. Хотя колицины не имеют отношения к факторам вирулентности, но участвуют в подавлении другой микрофлоры. В том числе и гены антибиотикорезистентности они часто присутствуют на плазмидах. Транспозоны не показаны на картинке, но для энтеробактерий они не являются векторами переноса, обычно нужен какой-либо дополнительный вектор, либо бактериофаг, либо плазмида. Между двумя инвертированными повторами, если находится какая-то информация, в цис-положении транспозаза может обеспечить перемещение этой генетической информации, затем фаг или плазмида передать её в другую бактерию. Грамположительные бактерии имеют ещё так называемые коньюгативные транспозоны, которые могут самостоятельно обеспечивать перенос своей ДНК в другую клетку бактерии без участия дополнительных векторов. Механизм передачи по типу плазмидной ДНК с небольшой вариацией.

Острова патогенности. У E.coli большинство из них представляют собой редуцированные бактериофаги. На стадии показана структура резидентных криптических бактериофагов. Большая часть редукции происходит, делеция генов, кодирующих гены капсида. Остаются гены рекомбиназы, значительная часть Rec-генов E.coli имеет выраженное фаговое происхождение. Несколько стандартных систем рекомбинации существуют, например RecN и RecO имеют такое фаговое происхождение. Каким образом можно остров патогенности найти? Может быть интегрированная эписома, фрагмент, попавший за счёт трансформации. Наиболее яркое свойство – отличный ГЦ-состав острова патогенности. У каждой бактерии своё содержание ГЦ-пар Dinococcus radiodurans – 68%, для большинства энтеробактерий – около 50%. То есть чужеродняа ДНК будет первоначально отличаться по ГЦ-составу. Другой фактор – наличие генов, не являющихся бактериальными: генов мобильности, как правило локализованных по краям такой области острова патогенности, транспозазы, либо различные гены мобильности плазмид, либо фрагменты генов бактериофагов – интегразы, эксцизионные ферменты. Часто интеграция таких островов идёт по области гомологии, обеспечиваючивающейся генами тРНК, один из факторов их использования, их избыточность (под каждый кодон несколько генов, и под каждую аминокислоту несколько кодонов), то есть эти гены совершенно безболезненно могут быть инактивированы. Они могут быть инактивированы, а могут и не инактивироваться, так как входящий фрагмент тоже имеет гены тРНК, по ним и идёт интеграция. После интеграции происходит ряд событий, на примере интеграции резидентного умеренного бактериофага. На слайде показана цепь событий.

1 стадия – весь геном бактериофага встраивается в определенную область за счет рекомбинации с геном тРНК, соответствующий фрагмент может быть вырезан. Баланс между интеграцией и эксцизией, но как только один из генов int или xis инактивируется или если в геноме делетирован участок, по которому идёт сайтспецифичекая рекомбинация. Со временем идёт уменьшение, инактивируются функции абсолютно клетке ненужные, так как у бактерий есть жесткий прессинг на удаление ненужной ДН К. Фаговые гены превращаются в псевдогены, происходят делеции различной длины. Значительная часть фагов может привнести какой-то хромосомный геном путём трансдукции. В конце концов, мы имеем видоизмененную ДНК, выравнивается ГЦ-состав, протекание нуклеотидных замен, системы репарации. На сегодняшний день секвенировано около сотни бактериальных геномов различных видов энтеробактерий, внутри каждого вида несколько штаммов. Первыми E.coli, однако геном штамма К12 довольно скучен, никаких островов патогенности нет, тщательный анализ других геномов, втом числе энтеропатогенных штаммов E.coli показывает, что есть базовый каркас, в который были добавлены свои участки ДНК. На слайде сравнение двух геномов энтеробактерий - есть синтеничные участки, есть совсем неродственные участки, есть делеции. Считается, что каркас около 4 млн н.п. От 4,6 до 5 с небольшим млн н.п.

До того как были секвенированы геномы Salmonella typhi и typhimurium считалось, что это различные организмы, оказалось, что разница между ними небольшие. Сейчас они объединены вместе в Salmonella enterica и считаются различными сероварами. У них есть одна и та же хромосома, но typhimurium содержит одну плазмиду, typhi – две. Немного различные спектр хозяев. То что Salmonella enterica серовар typhi является более специализированным, отражается даже в том, что у неё много псевдогенов. Патоген занимает удобную нишу, эволюция по пути специализации к одному виду, выбрасываются гены, которые не нужны. То же самое можно говорить о Yersinia. Y.pestis более специализированный вид, Y.entеrocoliticа и Y.pseudotuberculosum – менее. В целом патогены присутствуют практически в любых гуппах организмов, Грамотрицательные, в каждом семействе можно найти и патогенные, и сапрофитные и симбиотические. В пределах энтеробактерий есть E.coli – сапрофит, есть патогены – Yersinia, Salmonella enterica, есть фитопатогены – Erwinia, есть довольно интересные облигатные эндосимбионты насекомых – тли и мухи Цеце. Очень плотный эндосимбиоз, ни насекомое, ни бактерия не могу друг без друга. Необходима и для эндосимбиоза и для паразитизма – система прикрепления в организме, поверхностные структуры модифицированы, чтобы снизить иммунный ответ. Даже Rizobium имеет систему секреции третьего типа, любой субстрат, который транспортируется в клетку всегда распознаётся растительной клеткой есть супрессоры реакции гиперчувствительности. Для патогенов животных большое значение имеет изменчивость поверхностынх структур, то что находится на поверхности клетки должно видоизменяться очень-очень быстро. Пару слов о различных поверхностных структурах. Здесь в качестве примера приведены опероны, отвечающие за синтез пилей, их около десятка, и ССТТ. Есть подвид, отвечающих за синтез жгутика, а флагеллин довольно важный иммуноген, и есть СС, отвечающая за взаимодействие с патогенном. В случае Yersinia есть хромосомный вариант ССТТ и плазмидный вариант ССТТ. Два острова патогенности – один на хромосоме, другой на плазмиде, плюс два оперона, отвечающие за биосинтез жгутиков, их вообще три, но один разорван и полноценный функциональный флагеллин не кодируется. Две системы секреции, обеспечивающие синтез факторов вирулентности, нужны для взаимодействия с растением, а наличие двух жгутиковых систем – для изменения поверхностного антигена, можно обмануть иммунную систему, ту же самую функцию несет большое количество оперонов, кодирующих синтез пилей, отвечают за адгезивные свойства. Возможно изменять поверхностные свойства. Bacteroides в этом плане интересен тем, что очень активно идёт видоизменения активных структур. Основной фактор – переключение состава внеклеточных полисахаридов, огромное количество генов, синтезирует капсулу. Все гены собраны в опероны, перед каждым из оперонов генетический выключатель, два промотора конститутивные (а может и не выяснен механизм регуляции), сайт гомологии для рекомбиназы по обе стороны промотора, может его переворачивать, промотор то включен, то выключен за счёт сайт-специфической рекомбинации. Ферменты системы рестрикции-модификации. Такого же плана структуры характерны для Neisseria, которая быстро меняет поверхностные антигены. Ярче выражены у патогенов животных. В ходе одного заболевания даже меняются поверхностные антигены, обманывая иммунную систему.

Характерна редуктивная эволюция, даже Mycobacterium tuberculozis, которая имеет довольно 4 млн н.п 4000 с небольшим генов, медленно растут, медленно развивается инфекция. Mycobacterium leprае пошли ещё дальше по этому пути, редукция зашла довольно далеко, около половины псевдогены, 1200 псевдогенов, инактивированы гены, кодирующие липополисахариды, отвечающие за клеточную стенку, кислотоустойчивость, разлчные биосинтетические пути, в результате скорость роста очень низкая, вот и проказа странная болезнь, десятки лет до проявления симптомов. Экстримальный примеры у грамположительных бактерий _ различные микоплазмы, отдаленные родственники микобактерий. Около 500 генов, но и в порядке Микоплазм различная редукция. Например Mycoplazma pneumonia – около 1 млн н.п., микоплазмы даже с чуть более 1 млн н.п. Если говорить о случаях симбиоза и облигатного паразитизма, всегда возникает своего рода взаимозависимость, патогены мухи Тли и Цеце. Около 600 000 н.п. – только базовый метаболизм нуклеиновых кислот плюс трансляционный аппарат, пути биосинтеза аминокислот, практически урезаны системы, отвечающие за синтез кофакторов, основных витаминов. У симбионта мухи Цеце наоборот – синтез большинства витаминов, но урезан синтез аминокислот. У хозяина есть специальные клетки, где содержаться бактерии, бактериоцисты, то есть даже без них нормально не развивается организм. Редукция генома идёт интересно, самый простой путь – гомологичная рекомбинация. Самый простой вариант – это транспозоны, если они расположены в одинаковой ориентации, то рекомбинация между ними обеспечивает делецию фрагмента хромосомы. То есть в геноме остаётся либо ноль, либо один транспозон. Этому одному транспозону реокмбинировать уже не с кем, первыми исчезают гены сенсорных систем, также различные системы репараций, так как резкое воздействие негативно. Это накладывает отпечаток на генм, если редукция зашла далеко резко падает содержание ГЦ-пар. Чем больше АТ-пар, тем легче идут процессы транскрипции и трансляции, однако менее стабильна ДНК, но патогену это не так важно. Самый экстримальный пример – малярийный плазмодий (19% ГЦ-пар).