 |
Конструирование геномных библиотек. 5 глава
|
|
|
|
TBlastх – очень большая нагрузка на компьютер (в 36 раз больше).
Как работоть в программе – практика по геномике!!!
Компьютер позволяет определить вероятность случайного сходства между собой и не более того!!
Рис.3,44
Лекция 8
Эволюция геномов
Рис. 4,1
15 млр.л.н. – большой взрыв – первый шаг в эволюции геномов.
Есть смысл стартовать с клеточной формы жизни.
Сейчас общепринятым считается, что первичным носителем генетической информации является РНК. Причина: универсальная молекула, которая помимо кодирующей функции может обладать и ферментативной.
Рибозимы – молекулы, способные сами осуществлять процессинг. Встечаются у всех организмов. Примеры: в состав сплайсосомы входит малая РНК (у человека); рибонуклеаза П – включается в процессинг первичных транскриптов р тРНК у бактерий. Связана с белками. Если белки убрать, сродство фермента не меняется, только снижается скорость оборотов; многие вироиды – in vitro могут осуществлять не только сплайсинг, но и другие реакции – лигирования, синтеза НК, эндонуклеазные.
Рибозимы на основе РНК могут обеспечить свой метаболизм – одна и та же молекула может выполнять как кодирующую так и ферментативную функцию.
Рис. 4,2
В бульоне с одним рибонуклеотидом могли спонтанно спариваться путем комплементации и могла идти реакция полимеризации. РНК могла реплицироваться. Если молекула обладает и каталитической активностью, то они получают преимущества – так мог сформироваться аппарат репликации и трансляции.
Рис. 4,3
Самая простая возможность – одна и та же молекула обладала и кодирующей и рибозимной функцией. Первичная молекула должна катализировать свою реакцию и катализировать реакцию синтеза АМК.
|
|
|
Альтернативный, более сложный вариант – рибозимная часть – отдельная молекула.
Рис. 4,4
РНК→ДНК, только когда сформировался аппарат трансляции.
Первичный бульон был самовосстанавливающимся за счет восстановления рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды. Могла синтезироваться ДНК- такие молекулы будут более стабильными. Преимущества – подвергаются различным???????
Почему именно ДНК – носитель генетической информации?
Рис. 4,5
Схожий полимер – пептидная нуклеиновая кислота. В качестве остова – пептидная цепь. В принципе, могла обладать рядом преимуществ. Много работ по изучению, но все они далеки J
Откуда взялась клетка?
Самая распространенная гипотеза Опарина, но и она ничего не объясняет. После того, как сформировалась клетка началась биологическая эволюция.
Рис. 4,6
Дерево жизни. Отражает, насколько друг от друга группы организмов. Непонятно: как сформировались 3 н/царства?
Геном у всех организмов был одинаковый, за исключением прерывности/непрерывности.
Механизм эволюции геномов:
У прокариот – горизонтальный перенос генов – межвидовой перенос.
У эукариот – не наблюдается, характерен перенос от паразита к хозяину и наоборот. Паразиты могут быть прокариотами, поэтому в структуре генома наблюдаются прокариотические гены.
Рис. 4,7
События с геномами. Соответствуют уровню организации.
Геномные – для эукариот(растений, некоторых грибов и животных). После полиплоидизации многие со временем теряют часть приобретенных генов.
Между геномными и хромосомными – анеуплоидия (синдром Дауна).
Хромосомные. Достаточно крупные события, в отличие от генных, приводят к генетической изоляции.
Генные – механизмы те же ↑, но не блокируют межвидовые отношения.
Доменный – к формированию новых функций.
Нуклеотидный – вызывают сдвиг/возврат рамки считывания.
Откуда берутся изменения? Дупликации возникают в результате нарушения расхождения хромосом в мейозе. В лаб. Условиях можно вызвать колхицином.
|
|
|
Механизм дупликации в двух вариантах: 1 – автополиплоидия- между организмами 1 вида; 2 – межвидовая – между двумя различными видами. Как правило фертильны.
Рис. 4,9
Хромосомные перестройки – события, связанные с рекомбинацией. Необходима протяженная область гомологии – гомологическая рекомбинация. Имеет место, когда сначала произошла полиплоидизация – быстрее происходит перетосовка. Значительная часть материала утрачивается при делеции. Т.к. создается нагрузка – селекционное давление→сокращение генома. Всякая дупликация сопровождается последующей делецией!!!
Прогресс у полиплоидов только в тои случае, когда происходит быстрая редукция генома.
Таким образом, новая функция образуется в результате сначала дупликации, затем делеции.
Генный уровень – внутренние мутации, могут быть на нуклеотидном и генном уровне.
- Дупликация гена – две копии одного и того же гена, один инактивируется – образуется псевдоген, из которого может сформироваться что-то новое. В результате перетосовки – внутренней рекомбинации – образуется новая нуклеотидная последовательность, которая может синтезировать новый белок. Вероятность того, что новый белок будет функционоровать очень низкая у прокариот и выше у эукариот за счет прерывистого строения генов. Во многих случаях экзоны соответствуют если не доменам, то функционально обособленным учпсткам белковых структур. При рекомбинации между ними не происходит нарушения.
- Горизонтальный перенос – у прокариот. В результате б/ф, коньюгированных плазмид, транспозонов, трансформации.
Механизм появления новой функции генома – дупликация – 1 из копий должна быть выкинута – мутациооные изменения. Вероятность дупликации 1 на 1 млн.л., дивергенции – 0,1 за 1 млн.л., полная инактивация 1 гена 4 млн.л.. В результате появляются псевдогены – инактивированные гены, отличающиеся от функциональных последовательностей несущественно.
Р результате чего происходит инактивация гена:
1. Инактивация промотора (дупликация можетне захватывать промотор).
2. Утрачиваются сайты сплайсинга
3. Нонсенс мутации, приводящие к остановке трансляции
|
|
|
4. Миссенс мутации(не так существенно)
Любое из изменений делают ген неактивным, но при появлении первых из них появляются и следующие из них. В псевдогенах все равно сохраняются функциональные участки генома.
Лекция 8 (часть 2)
Эволюция глобулиновых генов хорошо изучена. Существует 2 кластера глобулиновых генов – α и β. Каждый из них содержит один/несколько функциональных генов и группу псевдогенов. Экспрессируются на разных этапах индивидуального развития. Выполняют различные функции. Не очень отличаются по последовательностям, но отличаются по свойствам, а точнее по сродству к кислороду: в эмбриональный период оно выше, чем у взрослого чела.
Рис 4,20
Откуда их так много? Первый глобин сформировался очень давно, он был еще у предшественников растений и животных.
Сначала происходила дивергенция, затем дупликация меоглобулина и гемоглобина, кластеры перемещались по хромосоме. В результате имеем нынешнюю структуру.
Рис 4,20
Время на формирование сложной структуры уходит очень много.
Рис 4,33, 4,36
Принципиально различная скорость эволюции кодирующих и некодирующих последовательностей.
Речь о молчащих сайтах.?????
В пределах кодирующих последовательностей эволюция накапливает нуклеотидные замены быстрее в 3 позиции, чем в 1 и2.
Откуда берутся дупликации? Стандартный механизм – гомологичная рекомбинация между сестринскими/различными хромосомами. Неравномерный кроссинговер приводит к тому, что какой-то фрагмент хромосомы дуплицируется.
В геномах большинства организмов характерно наличие большого числа тандемно повторяющихся последовательностей рДНК.
Для бактерий характерно меньшее число рДНК, которые разбросаны по геному.
Есть сателитные Днк – более мелкие повторы, могут иметь разную структуру. Н: минисателиты риса, алу повторы чела. Сателлиты берутся от неравномерного кроссинговера, либо за счет проскальзывания вилки
Рис 4,27
Бывают ситуации, когда в популяции присутствует различное число разных повторов и тогда неравный кроссинговер может обеспечить гомогенизацию. Тандемные повторы являются идентичными.
|
|
|
Рис 4,29
У большинства членистоногих очень короткие сателитные повторы, но присутствуют в огромном количестве.
Рис 4,30
У человека практически 1 алу повтор, у мышей – 4 повтора.
Рис 4,31
Если какая-то последовательность повторяется. Поскольку конец вновь синтезированной ДНК подвижен, может образовываться выпячивание и повтор может подвинуться. Срабатывает для коротких последовательностей.
Рис 4,32
Принципиально механизмы эволюции не отличаются от механизмов генного уровня. А выделяют этот уровень, т.к. процессы, связанные с репликацией доменов отвечают за возникновение новых функций.
Сложно сказать, какие сначала были гены – прерывистыми/нет. Николайчику Е.А. J больше нравится версия, что сначала были прерывистые гены, из которых произошли непрерывистые.
Суть в том, что прерывистая структура ускоряет процесс эволюции, т.к. экзоны, как правило, соответствуют кодонам/более мелким функциональным структурам. В результате рекомбинации между участками происходит перенос функционального модуля в другой белок. В результата получается новый функциональный ген.
Рис 4,35
Предполагает, что первоначально геном состоял из очень коротких генов, каждый из которых синтезировал короткий пептид, который соответствовал одному домену. Затем пептиды собираются в мультисубъеденичный белок, который выполняет свои функции за счет тесной ассоциации пептидов. Сейчас это соответствует мультидоменному белку, в котором пептиды объединены ковалентной связью. Для того, что бы он сформировался, необходимо, чтобы короткие гены были соединены в один ген и транскрибировались и транслировались совместно. В результате такой же белок получается. Переход от короткого непрерывного гена к одному прерывистому.
Новые гены у более продвинутых организмов появляются в результате рекомбинации уже имеющихся белковых структур. Все разнообразие геномов сводится к тысячи базовых белковых доменных структурам.
Рис 4,38
Ортологи – гены, выполняющие одну и туже функцию, образовались в результате дивергенции одного вида.
Паралоги – гены, имеющие сходные нуклеотидные последовательности, выполняющие различные функции. Произошли в результате внутригенной дупликации и последующей дивергенции функций.
Бывают сложные ситуации. Н: в геноме предкового вида произошла внутригенная дупликация, затем дивергенция вида на два (А и Б). В ходе эволюции накапливались изменения. В каждом виде есть по два гена и все сходны. Виду А не нужна функция первого гена и он утрпчивается, виду Б не нужен второй ген. У каждого осталось по одному гену. Кем являются эти гены? Паралогами.
|
|
|
Таким образом, только по сходству нуклеотидных последовательностей невозможно установить функцию и происхождение.
Рис 4,39
Сейчас считают, что эукариотическая клетка – результат многочисленных симбиозов, т.е. геном является гибридным. Некоторые считают, что ядро – тоже результат симбиоза. Хлоропласты и митохондрии – 100%. Ядерный геном – гибрид, в который мигрировала значительная часть генов митохондрий и хлоропластов.
Лекция 9:
Знать: типы транспозонов, отличие Тн прокариот и эукариот, классы Тн, нормально классифицировать. Любые мобильные генетические элементы идентифицируются легко по нуклеотидной последовательности. Все без исключения Тн ограничены повторами по концам. В зависимости от типа транспозона структура этих хвостов отличается, но наиболее традиционная организация структуры представлена на СЛАЙДЕ:
По концам транспозона обязательно есть короткие или не очень короткие инвертированные повторы, зеркальное отражение друг друга. В точке, где Тн встроился в геном, всегда есть короткие прямые повторы, от 2 до 9 нуклеодидов, в некоторых случаях до 11. 2 – это только у эукариотических Тн, а именно у ретротранспозонов. Обычно от 4 до 9 нуклеодидов в прямых повторах. Инвертированные повторы внутри транспозона обычно имеют размер пары десятков нуклеотидных пар, от 15 до 30. В некоторых случаях могут быть очень длинными.
СЛАЙД: откуда берутся прямые повторы по концам транспозонов. Они связаны с работой фермента, который обеспечивает их перемещение. Это транспозаза. Она делает ступенчатый надрез в сайте-мишени, всегда для прокариот, но также и для перемещения эукариотических ретротранспозонов. Происходит дупликация концов за счет того, что стандартные системы репарации достраивают те одноцепочечные участки, которые остаются одноцепочечными после встраивания Тн. Остальные детали более специфичны для отдельных групп организмов. Прокариоты: мобильные генетические элементы делят на 2 класса: IS-элементы и собственно транспозоны. Принципиальных отличий в механизме премещения между ними нет. Это достаточно искусственное разделение. IS-элемент отличается тем, что транспозон обязательно несет какую-то функцию, не имеющую отношения к транспозиции. Т.е. транспозон – это IS-элемент плюс еще какой-то ген. IS-элемент – это «голый» мобильный элемент с повторами, необходимыми для перемещения, и с геном транспозазы. Транспозоны в свою очередь можно разделить на два класса: простые и составные. Простой транспозон обычно имеет короткие повторы на концах, ген транспозазы внутри и еще какой-нибудь ген во внутренней части транспозона. Повторы всегда короткие. У составных Тн повторы на концах очень длинные, от 1 000 до 1 500, 2 000 и даже неск. тыс нукл. пар. Каждый из этих повторов представляет собой стандартный IS-элемент. Короткие инвертированные повторы по концам, ген транспозазы внутри, все как у IS-элемента. Составной Тн так и называется потому что состоит из двух IS-элементов, а между ними – уникальная последовательность, например, ген антибиотикорезистентности. Б о льшая часть составных транспозонов за редким исключением имеет один дефектный повтор. То есть как правило только один из повторов по краям кодирует функциональную транспозазу. Во втором повторе транспозаза инактивирована. Пример: бактериальный Tn5. Кодирует резистентность к каномицину. По концам – Is50, правый из них содержит только одну мутацию, которая инактивирует транспозазу и одновременно эта нуклеотидная замена создает промоторную последовательность, с которой считывается ген резистентности к каномицину. Эта нукл. замена делает хороший «-35»- сайт, обеспечивающий транскрипцию гена устойчивости к каномицину. Транспозаза использует инвертированные повторы по концам для перемещения мобильных элементов. Связывание транспозазы с ними необходимо для правильного надрезания донорной молекулы и последующего перемещения транспозона. В составном транспозоне работает одна транспозаза. Крайние части по концам инвертированных повторов – тоже повторы, такие же, как у IS-элементов. Транспозаза действует в цис-положении на любую пару инвертированных концевых повторов, которые есть на одной молекуле ДНК. Просто эффективность распознавания повторов патдает с увеличением расстояния между ними, и чем дальше они от гена транспозазы, тем также хуже распознаются. Наиболее эффективно перемещается просто IS-последовательность. Ее перемещение сложней детектировать, т.к. нет маркера антибиотикорезистентности. Потому на них не обращают внимания. Сам функциональный повтор скачет гораздо лучше, чем целые Tn. Транспозаза одного мобильного элемента может обеспечить перемещение всех других элементов. При этом дефектный элемент будет перемещаться лучше, чем полностью транспозон. Когда транспозон встроен в фазмиду, получается следующее: СЛАЙД если в pUC18 размером 2,7 кВ встроить Tn10, который имеет размер 10 кB нукл пар., то плазмидная часть в составе этой фазмиды намного меньше, чем транспозоновая. Из такой структуры эффективность транспозиции самого транспозона, т.е. прямая транспозиция, будет ниже, чем так называемая инвертированная транспозиция. из кольцевой молекулы выщепляется участок плазмиды с повторами по краям. Фактически это уже новый транспозон, несущий плазмидный маркер антибиотикорезистентности. Так действительно возникают новые транспозоны. IS-элементы – основная движущая сила всех мобильных генетических элементов. Характеристики IS-элементов: СЛАЙД. Показаны названия, повтор мишени, инвертированные повторы и их размеры. В мишени дупликации от 4 до 9 нуклеотидных пар. Чуть реже – 11-13. От 9 до 41 нуклеотидных пар непосредственно распознается ферментом. Самый короткий - IS1. Он достаточно эффективно перемещается. Существенный фактор – различие в специфичности перемещения. Всегда фермент связывается скакой-то определенной последовательностью нуклеотидов, просто она может быть длинней или короче. Чем она короче, тем более случайным будет процесс распознавания. Транспозазы сильно варьируют по своей специфичности. Считается, что для Is1 характерна случайная транспозиция. Tn9 фланкирован двумя Is1, между ними – ген хлорамфеникол-резистентности. Для мутагенеза капризен. Скачет хорошо и часто, но всегда в одно и то же место. А Is50, для которого прописаны в таблице горячие точки, достаточно случайно работает. Информация о «горячих точках», т.е. сайтах наиболее частого встраивания, берется из опытов на плазмидах. Например, для pBR322 четверть всех инсерций будет в одну-единственную точку этой плазмиды. А 75% всех инсерций будут случайно разбросаны по плазмиде. Так же и в бактериальном геноме и хромосомах. Есть мобильноые элементы, которые встраиваются очень выборочно, в конкретные последовательности. Tn7 – пример транспозона, который кодирует резистентность к триметаприму и встраивается в геном ешерихии коли в один-единственный сайт. Эта последовательность известна, длинная, похожа на attв-сайт для фага лямбда. Даже механизм перемещения немного отличается от такового других транспозонов. Т.е. от абсолютно рандомного встраивания до строгой специфичности. Механизм транспозиции: есть 2 приципиально различных по результату механизма транспозиции, консервативный и репликативный. При консервативной транспозиции транспозон вырезается из донорной молекулы и встраивается в реципиентную, оставляя двунитевой разрыв в молекуле ДНК. При репликативном механизме он не вырезается, а в реципиентной молекуле создается его копия без утраты его в исходном месте. Между этими двумя механизмами очень много общего. Репликативная транспозиция первой была изучена. Консервативная транспозиция – небольшая модификация этого процесса. Любая транспозиция всегда начинается с однонитевых разрывов донорной и реципиентной молекул.
СЛАЙД. Транспозаза связывается с инвертированными концами транспозона и димеризуется. То есть для инициации транспозиции должна сформироваться промежуточная структура в виде петли. Транспозаза режет одну нить по концу повтора и этот же активный сайт распознает сайт-мишень на другой части этой же цепи ДНК. Поскольку активные центры подвинуты друг относительно друга, в результате образуется ступенчатый разрыв. Слайд – результат. Затем концы стыкуются. Формируется промежуточная структура. Лучше всего репликативная транспозиция описана в книге Спирина. После стыковки однонитевых разрывово формируется структура, похожая на репликативную вилку. С каждой стороны – свободный 3прим-ОН конец, с которого начинается полимеризация. Когда цепи разделяются, получается структура коинтеграта, объединнной донорной и реципиентной молекулы. При достройке концов донорной и реципиентной молекул они бы слились. Следующий шаг – разделение двух молекул. После этого в каждой из молекул остается копия такого транспозона. За разделение коинтеграта отечает сам транспозон. По механизму сайтспецифической рекомбинации. Фермент – резолваза. Кодируется самим Тн. Однако если инактивировать резолвазу, разделение все равно будет происходить за счет гомологичной рекомбинации. Но резолвазная система обеспечивает гарантированное разделение рекомбинацией, то есть разделение будет обязательно на 2 автономные молекулы. Гомологичная рекомбинация расцепит только половину молекул. Она работает в обе стороны: на разделение и на слияние, они будут в динамическом равновесии. Резолваза же только разделяет. Еще один СЛАЙД: фаг мю. 38 кВ. Один большой транспозон. В его состав помимо двух генов (два разных мономера транспозазы, из них получается в итоге гетеротетрамер) входят гены, нужные для упаковки этого фага, репликации его ДНК. Механизм репликации – собственно транспозиция. Перед упаковкой фаг очень активно скачет по геному и затем пакующие ферменты вырезают его копии из генома вместе с небольшим куском геномной ДНК. Упаковывается сам фаг и около ста нуклеотидных пар с одного его конца и с другого. Эти отрезки всегда произвольные. Существует в клетке в виде профага. Способен перемещаться и по коинтегративному механизму, и по репликативному. При первичной
интеграции в хромосому фаг использует консервативный механизм, а потом при паковке репликативный. То есть пока нет достаточного количества копий фага, убиваь клетку нет смысла. А она погибнет при консервативной транспозиции. СЛАЙД. интермедиат из двух кольцевых молекул. Два способа разделения такой структуры. Если внести двунитевой разрез, то это консервативная транспозиция. Если не вносить, то получаем коинтеграт, это уже будет репликативный механизм. Фаг мю контролирует активность своей транспозазы: в норме этот белок обеспечивает репликативную транспозицию, а при первичной инфекции за счет модификации активности фермента идут дополнительные разрезы, которые полностью вырезают его из донорной молекулы и встраивабт в молекулу-реципиент. Это имеет смысл, так как донорная молекула в данном случае линейная молекула ДНК. Если бы и здесь был репликативный механизм, то коинтеграт был бы линейным. Бактерия бы погибла за счет того, что линейный геном не смог бы реплицироваться. Даже при консервативной транспозиции можно выделить пожожую промежуточную структуру. Конкретные детали при перемщении Тн по консервативному механизму могут существенно различаться. СЛАЙД: варианты транспозиции. Ковалентное замыкание концов (плазмидообразная форма) для транспозонов тоже возможна. Наиболее хорошо изученные транспозоны - семейство TnA = Tn1, Tn3, на самом деле это один и тот же транспозон просто исторически был назван немного по-разному. Есть между ними небольшие различия, но они сформировались в лабораторных условиях. Просто организованы, все кодируют резистентность к ампициллину, бета-лактамазу одного класса, несут ген транспозазы, резолвазы и сайт для действия последней. Он же – res-сайт. В нем происходит разрешение коинтеграта. Тот же сайт фактически и контролирует активность транспозазы. Резолваза выступает еще и в качестве транскрипционного регулятора. Операторная часть одного гена увеличена, к нему присоединяется резолваза. Она блокирует транскрипцию транспозазы, а связывание с другим сайтом стимулирует активность резолвазы. Когда транспозон появляется, то транспозаза активничает, затем начинает синтезироваться резолваза. Она выключает транспозазу и стимулирует синтез самой себя. В итоге сначала консервативная транспозиция, затем стимулируется разделение коинтеграта. Для перемещения транспозона не нужно ничего, кроме инвертированных повторов по концам. Именно их (отрезки в пару десятков нуклеотидов) распознает транспозаза. Ген транспозазы даже не должен располагаться между этими транспозонами. Способность транспозонов к инвертированной транспозиции широко применяется для транспозонового мутагенеза. СЛАЙД: мини-производное от Тн5, плазмида-самоубийца. При введении в клетки мутагенизированного штамма реплицироваться не может. Плазмида кодирует ген транспозазы. Рядом с этим геном транспозазы встраивается одно из мини-проиводных транспозона. Есть разные варианты таких производных. СЛАЙД: гены устойчивости к антибиотикам. От Тн осталось 19 нуклеотидных пар с одной стороны и с другой. Такая конструкция помещается рядом с геном транспозазы и когда вектор вводится в реципиентную клетку, мини-транспозон перемещается из этой молекулы в хромосому. Плазмида утрачивается, реплицироваться она не может. В реципиенте (в его хромосоме) остается только одна копия транспозона. Более сложные производные - на СЛАЙДе. Помимо резистентности к антибиотикам добавлены репортерные гены. Обычно это гены ферментов без промотора и в некоторых случаях без рибосомсвязывающего сайта. Инсерция такого транспозона внутрь какого-то гена при условии, что он встроен в правильной ориентации, помещает репортерный ген под промотор гена, в который он встроен. Это удобно использовать в лабораторной практике. Этот ген как правило кодирует фермент, дающий цепную реакцию. Позволяет судить об активности мутантного гена в разных условиях. Т.е. по измерению активности фермента или просто по визуальному наблюдению, можно определить активность гена и измерить ее либо ферментативно, либо люминометрически. Транспозоны сейчас используют реже, но их значение не уменьшается. Цифры, получаемые в результате таких репортерных исследований, более точные. Если сравнивать их с транскрипционными исследованиями, в классическом варианте - микрочипы, то все же транскрипционные методы требуют уточнения, они не очень точные.
Транспозоны эукариот. Первые транспозоны были открыты именно у эукариот. В 40х годах были опубликованы статьи Барбары МакКлинток по исследованиям мутаций кукурузы. Получила за это заслуженную Нобелевскую премию через 40 лет после выхода статей. Она объяснила существование транспозонов, не зная их генетической структуры, используя только генетические методы. Четкие, красивые эксперименты. Классические транспозоны Мак Клинток интересны тем, что похожи на бактериальные транспозоны, которые перемещаются по консервативному механизму. Тн вырезается их того места, где он был и встраивается в новое место. Также они похожи на бактериальные консервативные Тн тем, что достаточно легко можно сделать мини-производное этих транспозонов. Делеция гена транспозазы инактивирует конкретный транспозон, но если в в цис-положении присутствует ген транспозазы, он будет распознавать инвертированные концы и будет обеспечивать перемещение транспозона. Структура этих транспозонов: СЛАЙД. Классический AS-элемент, активатор по Мак Клинток. Содержит классические повторы по концам. Внутри - одна существенная для перемещения рамка считывания, один ген, который разбит на 5 экзонов, разделенных интронами. Чтобы интрон перемещался, это все должно транскрибироваться, процессироваться, транслироваться, и результат – транспозаза, которая по структуре соответствует бактериальной транспозазе. Механизм перемещения точно такой же. Мак Клинток работала с транспозонами двух типов: она выделяла активатор и диссоциатор. Оказалось, что диссоциатор – дефектная копия активатора. Сейчас изучены уже различные линии диссоциаторов. Это делеции различной протяженности внутренней части активатора. То есть это семейство транспозонов, в котором есть один активный, кодирующий транспозазу, и его различные делеционные производные, которые активной транспозазы уже не имеют. Таких семейств в геномах растений достаточно много, наиболее известные показаны на СЛАЙДе. Активатор и диссоциатор: SPM – супрессор-мутатор и DsPM (нет конкретной расшифровки, дефектный s-pm. Они же - энхансер и ингибитор. Есть еще мутатор и производное от этого мутатора. У кукурузы транспозоны лучше изучены. Для всех эукариот совершенно общая тенденция: классический ДНК-транспозон у эукариот очень быстро накапливает различные делеционные производные. Если в геноме есть активный транспозон, то он будет обеспечивать перемещение себя самого и разных производных, которые сами транспозазу не кодируют. Чем ближе концы инвертированных транспозонов, тем больше он перемещается. Парадокс: делеционные производные транспозона могут перемещаться лучше, чем активный транспозон. Даже если дефектные мутанты перемещаются с меньшей частотой, все равно с течением времени их количество накапливается. Т.е. если такой транспозон прыгнул, то появляется его копия в геноме. И транспозаза должна «отвлекаться» и на нее. Конечный результат: чем больше накапливается делеционных производных, тем менее эффективным оказывается перемещение всего семейства транспозонов. Транспозаза должна связываться с каждой из этих копий. И ее не хватает. В конце концов делеционных копий оказывается слишком много, случайным образом происходит инактивация последнего активного транспозона, и все семейство вымирает. Они по-прежнему есть в геноме, их легко можно детектировать, т.к. их структура стандартна, но они больше не перемещаются. В геноме человека достаточно много семейств вот таких ДНК-транспозонов, и они все без исключения неактивны. Это уже реликты мобильных генетических элементов такого класса. Есть СЛАЙД, который показывает различие в эффективности транспозиции таких транспозонов и ретротранспозонов эукариот. СЛАЙД: про супрессор и мутатор. Модификации такой классической схемы: это семейство элементов: SPM-элементы и энхансеры – почти одно и то же. Они имеют одинаковую структуру. Помимо гена транспозазы (11 экзонов) у этих Тн есть еще две открытых рамки считывания. Эти гены имеют отношение к перемещению этих элементов. Обе рамки располагаются внутри длинного интрона. Это гены хелперных белков, которые способствуют активации транспозазы. Вроде бы одна из этих рамок не критична для перемещения. Но как мимимум одна из них необходима. Если ее инактивировать, то получается дефектное производное этого транспозона, которое перемещается, но со значительно меньшей эффективностью. Полностью инактивирующая мутация должна охватить один из экзонов гена транспозазы. Другие ДНК-транспозоны эукариот: еще у растений – LINE-транспозоны (миниатюрные), непростая схема перемещения. У животных: есть ДНК-транспозоны. Классические из них – это P-элемент дрозофилы. P-элементы появились у Drosophila melanogaster в 40е годы 19 века. До этого все формы, которые выделялись из природы, не имели P-элементов. А в 50х P-элементы находились почти у всех диких форм. P-элементы очень быстро распространились в природных популяциях. Их распространение между популяциями обеспечивают наездники. Паразиты захватывают часть цитоплазмы и впрыскивают уже в следующую жертву. В результате происходит распространение транспозона.
|
|
|
