Описание микроскопа и работы с ним. 4 страница

Морских свинок берут из клетки одной рукой, обхва­тывая туловище позади передних конечностей. Морских свинок фиксируют двумя руками — одной зажимают задние ноги, другой — передние ноги и голову (б).

Белых крыс захватывают рукой вокруг туловища позади передних конечностец. Большой палец должен находиться под нижней челюстью. Частая ошибка в обращении с крысами — слишком крепкий захват живот­ного. Это вызывает у крыс тревогу и она может укусить. Если крыса проявляет агрессивность, то следует поль­зоваться корнцангом.

Белых мышей из клетки извлекают корнцангам или берут за хвост »и быстро придают мышке висячее поло­жение вниз головой. Затем пускают мышь к себе на халат или на стол, быстрым движением схватывают ее за кож­ную складку в области затылка и фиксируют мышь, растягивая ее двумя руками. Все, манипуляции следует делать быстро во избежание покусов. Если не удается схватить мышь за кожу в области затылка, можно пред­варительно, держа мышь за хвост, проделать несколько вращательных движений.

При работе без помощника мышь фиксируют двумя длособами. 1. Захватывают ее кровоостанавливающим пинцетом (Пеана или Кохера) за кожную складку в области затылка и одевают пинцет кольцами для паль­цев на какой-либо предмет (например, на стержень шта­тива для бюретки). Одной рукой удерживают мышь за хвост, а другой — производят инъекцию. 2. Большим и указательным пальцами быстро схватывают мышь за кож­ную складку в области затылка, переворачивают ее брюш­ком кверху, захватив при этом хвост и левую заднюю конечность мизинцем и безымянным пальцем этой же руки. Инъекцию производят другой рукой (в, г).

Голубей фиксируют одной рукой, обхватывая туло­вище и прижимая одновременно оба крыла и обе ко­нечности к телу.

При фиксации лабораторных животных следует соб­людать осторожность, чтобы обезопасить себя и не при­чинить вреда животным грубой фиксацией.

Способы заражения лабораторных животных. Ла­бораторных животных чаще всего заражают подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно. Иногда прибегают к внутрикожному, внутримозговому способам «заражения; заражают жиротных через пищеваритель­ный тракт, а также путем аппликации материала на коньюнктиву или на скарифицированную поверхность кожи. На месте инъекции шерсть выстригают, кожу обрабатывают спиртом или 2%-ным раствором карбо­ловой кислоты. Подкожно материал вводят кроликам в области спины или живота; морским свинкам в области живота; белым'мышам— в области спины у корня хвоста. Чтобы предупредить обратное вытекание. материала, место укола захватывают пинцетом и сжимают; можно заклеить его кусочком ваты, смоченным коллодием. Объем вводимого подкожно материала обычно для кро­лика 0, 5—2 мл; для морской свинки — 0, 5—1 мл; для белой мыши 0, 2—0, 5 мл.

При внутримышечном способе заражения материал вводят кроликам, морским свинкам и белым мышам в толщу мышц с внутренней стороны бедра; голубям — в грудную мышцу после предварительного выщипыва­ния перьев на месте инъекции, при этом иглу следует направлять в сторону головы, а не в сторону туловища, т. к. в последнем случае можно повредить брюшину.

При внутрибрюшинном способе заражения животное фиксируют вниз головой (во избежание ранения кишеч­ника). Применяют короткие, с тупым жалом иглы. Инъ­екцию производят в левую нижнюю треть живота. Сна­чала иглу направляют горизонтально, прокалывая одно­временно кожу, мускулатуру и брюшину. Затем пере­водят шприц в вертикальное положение и медленно вво­дят материал.

Внутривенный способ заражения применяют чаще все­го у кроликов. Инъекцию делают в краевую вену уха. Шерсть на месте введения выщипывают, место инъек­ции дезинфицируют. У основания уха сосуд передавли­вают пальцами для лучшего наполнения его кровью. Мож­но предварительно протереть ухо ксиолом или пощелкать по нему. Это вызывает наполнение сосудов кровью и облегчает введение иглы в вену. Левой рукой берут ухо кролика так, чтобы указательный палец был снизу, а большим пальцем прижимают ухо сверху. Для удобства ухо слегка перегибают на указательном пальце. Пра­вой рукой берут шприц, снабженный тонкой иглой, и вводят иглу в вену по ходу тока крови (по направлению к голове) (рис. 13). При правильном введении иглы в вену материал поступает свободно при легком нажа­тии на поршень. При неправильном положении игль? на месте инъекции образуется вздутие; в этом случае инъекцию повторяют ближе к основанию уха.

Материал внутривенно следует вводить медленно. Доза для кролика составляет обычно 1—5 мл. После инъекции на место укола накладывают кусочек ваты.

После заражения животных помещают в отдельные клетки (мышей можно содержать в стеклянных банках, закрытых сверху металлической сеткой). На клетки или банки наклеивают, этикетки с указанием номера клетки или банки, фамилии ответственного за опыт сотрудни­ка (учащегося), даты, числа и вида животных, чем зара­жены животные, способа заражения, введенной дозы, как помечены животные.

Зараженных животных содержат в отдельных помеще­ниях, изолированно от здоровых; их обслуживает отдель­ный персонал.

Вскрытие трупов лабораторных животных. Павших лабораторных животных вскрывают и проводят патоло- гоанато. мические и микробиологические исследования.

Вскрытие трупов следует производить тотчас после смерти животного. Трупы вскрывают на столах, обитых оцинкованным железом или в металлических ванночках. Д«ця удобства их укрепляют булавками, кнопками или гвоздями на деревянной или пробковой доске, которую" затем помещают в ванночку. Можно залить ванночку расплавленным воском. На застывшем воске труп фик­сируют булавками. После вскрытия воск обеззаражи­вают перетапливанием.

Перед вскрытием приготавливают инструменты (скальпели, ножницы, пинцеты), а также все необхо­димое для производства посевов и изготовления мазков: предметные стекла, пастеровские пипетки и бактериоло­гические петли, шпатель для прижигания, спиртовку, питательные среды, карандаш по стеклу, сосуд с дезин­фицирующей жидкостью, тетрадь для записи.

Для дезинфекции внешних покровов и для уничто­жения накожных паразитов трупы на несколько минут погружают в 2%-ный раствор карболовой кислоты. Мож­но овлажнить шерсть спиртом и затем обжечь ее.

Вскрытие начинают разрезом по белой линии живо­та от лобка до шеи. Кожу отпрепаровывают по сторо­нам. Грудную полость вскрывают ножницами, разрезая сначала диафрагму, затем ребра с обеих сторон по месту прикрепления их к грудной кости, последнюю отделяют от трупа. Для лучшего осмотра органов брюшной по­лости разрезают брюшную стенку перпендикулярно пер­вому разрезу в обе стороны до поясничных позвонков. При необходимости вскрывают черепно-мозговую по- ЛЬсть и исследуют головной мозг.

. После беглого осмотра органов делают посевы из внутренних органов и крови сердца (см. занятие 6), изготавливают мазки-отпечатки из органов (см. занятие 3) и после этого производят тщательное патологоанато- мическое исследование. Результаты осмотра трупа и па- тологоанатомического исследования вносят в бланк ла­бораторной экспертизы.

Инструменты после работы стерилизуют кипячением;

труп животного сжигают или автоклавируют. Стол и ван­ночки заливают на 2 ч 3%-ным раствором карболовой кислоты или 5%-ным раствором лизола. Столы можно овлажнить спиртом и затем прожечь. Клетку, в которой пало лабораторное животное, дезинфицируют, подстилку и остатки корма сжигают.

Взятие крови у лабораторных животных. Кровь у •лабораторных животных берут для исследования, а так­же для изготовления комплемента и сывороток, необ­ходимых для серологических реакций. У морских сви­нок и кроликов кровь можно брать из ушной вены или из сердца.

Из ушных вен кровь берут путем надреза или проко­ла сосуда. Удобно брать кровь из краевой вены ух^а. Шерсть на месте операции выстригают или выщипы­вают. Для лучшего наполнения сосудов ухо протирают ваткой, смоченной ксилолом. У основания уха сосуд зажимают и острым скальпелем или бритвой делают поперечный надрез его. Первую каплю крови убирают стерильной ватой, затем к месту надреза приставляют пробирку (14 Хб5 мм) и заполняют ее кровью (рис. 14, а), причем кровь должна идти непрерывной струей по стен­ке пробирки. У белых мышей кровь берут, отсекая кончик хвоста, или путем укола пастеровской пипеткой в сосу­дистое сплетение, расположенное в области внутреннего угла глаза.

Большое количество крови (и более стерильно) мож-. но взять у кролика или морской свинки при помощи пункции сердца. Помощник фиксирует свинку на столе в спинном положении, чуть наклонив ее на себя; левым боком к оператору. Указательным пальцем левой руки^ оператор отыскивает точку, где сильнее всего ощущает­ся сердечный толчок. Этой точкой обычно'является се­редина грудной клетки, несколько влево (0, 5—1 см) от средней линии. Для получения крови берут 5—10-грам-₁ мовый шприц с толстой иглой длиной 2 см. Жало иглы должно быть предварительно слегка сточено. Шерсть на месте укола выстригают, место укола дезинфицируют.

Грудную стенку прокалывают, держа шприц правой рукой в несколько наклонном положении, спереди назад (рис. 14, б). При проколе надо указательный палец держать на штоке поршня и стараться слегка отодви­гать его, чтобы в цилиндре создавалось отрицательное давление (разряжение воздуха). При правильном попа­дании поршень легко поднимается, а цилиндр заполняет­ся кровью.

От взрослой морской свинки можно взять однократ­но 5—6 мл крови, от кролика — до 10 мл крови. После этого животному тотчас вводят подкожно физраствор, подогретый до температуры тела, соответственно ко­личеству взятой крови. Повторно кровь у этого же живот­ного можно брать не ранее, чем через 10-^15 дней.

«Занятие 9. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ И В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК КУРИНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

Задание. 1. Провести овоскопию куриных эмбрионов ДМя отбора живых оплодотворенных эмбрионов.

2. Научиться заражать куриные эмбрионы в аллан- тоисную полость.

3. Овладеть техникой вскрытия эмбрионов.

4. Ознакомиться с методом культивирования клеток куриных фибробластов (КФ) и техникой их заражения.

Основное оборудование и материалы. Куриные эмбрионы на 9—10-й день инкубации, вируссодержащий материал (вакцинный штамм ви­руса болезни Ньюкасла), органы и ткани животных, павших от не­заразных болезней. Физиологический раствор, мясо-пептонный бульон (в колбах), спирт, йодированный спирт, 5%-ный раствор йода, анти­биотики (пенициллин, стрептомицин), 0, 2%-ный раствор трипсина, солевой раствор Хенкса, питательная среда с 0, 25%-ным ФГМС на растворе Эрла, нормальная сыворотка крови крупного рогатого скота (готовые растворы и среды приобретают через конторы «Зооветснаба»). Овоскоп (ящик с электролампочкой внутри и отверстием для про­смотра эмбрионов), штативы для куриных эмбрионов, чашки Петри, конические колбы на 100—250 мл, мерные стаканчики, пробирки, баночка с тампонами, шприцы (по 1 мл) с иглами, резиновые пробки, * 'стеклянные воронки, пинцеты, ножницы с прямыми и изогнутыми концами, пастеровские пипетки, мерные пипетки на 1—2 мл, иглы для взятия крови, вата, марля, парафин или лейкопластырь, фарфоро­вые ступки с пестиками, газовые или спиртовые горелки, магнитная мешалка, стерилизатор, счетная камера Горяева, микроскопы, тер- ^ мостат.

Место занятия. Лаборатория техникума, вирусологический отдел ветеринарной лаборатории.

Методика проведения занятия. Преподаватель показывает как производится овоскопия (просвечивание) куриных эмбрионов с целью установления их развития. Обращает внимание на то, как отличать живых эмбрионов от погибших. Учащиеся самостоятельно овоскопи- руют эмбрионы, отмечают карандашом места проколов скорлупы.

Затем преподаватель демонстрирует различные методы зараже­ния куриных эмбрионов, после чего учащиеся самостоятельно зара­жают куриные эмбрионы в аллантоисную полость. Для заражения

можно использовать вакцинный штамм вируса ньюкаслской болезни, органы и ткани животных, павших от незаразных болезней или сте­рильный физраствор. Зараженные эмбрионы помещают в термостат. Преподаватель показывает технику вскрытия эмбрионов; учащиеся самостоятельно вскрывают 1—2 эмбриона и описывают наблюдаемую при этом картину.

На этом же занятии преподаватель объясняет для чего служат клеточные культуры, демонстрирует под микроскопом заранее приго­товленные незараженные культуры куриных фибробластов и культу­ры этих, же клеток с наличием цитопатогенного действия (ЦПД), вызванного вакцинным штаммом вируса болезни Ньюкасла (ЦПД можно имитировать прогреванием культуры клеток до закипания в них сре;? ы). Затем преподаватель объясняет как изготавливают куль-" туры КФ и как производят их заражение. После этого учащиеся самостоятельно проводят изготовление и заражение культуры клеток.

Заражение куриных эмбрионов производят с диаг ностической целью для обнаружения и идентификации вирусов, а в биологической промышленности — для изго­товления вакцин и антигенов. С этой целью берут свежие оплодотворенные инкубированные при 38°С яйца, озоско- пируют (просвечивают) их в темной комнате, чтобы выявить неоплодотворенные яйца и отличить живые эмбрионы от погибших. Неоплодотворенные яйца про­зрачны. В оплодотворенных инкубированных яйцах обнаруживают движение эмбрионов и наполнение кровью сосудов хориоаллантоисной оболочки.

Для заражения отбирают яйца с живыми эмбрио­нами, отмечают простым карандашом границу пуги (воздушное пространство со стороны тупого конца яйца). Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим мате­риалом (органы и ткани больных животных и т. п. ). Его растирают в фарфоровой ступке, суспендируют в- мясо-пептонном бульоне (1: 10), фильтруют через 3—4 слоя марли, добавляют растворы антибиотиков (100— 200 ЕД пенициллина и 100—150 ЕД стрептомицина на 1 мл суспензии). Заражают эмбрионы в стерильных условиях — в боксе, который представляет собой специ­альную комнату с остекленными перегородками. Пред­варительно бокс дезинфицируют — распыляют 5%-ный раствор карболовой кислоты, после чего включают бакте­рицидные лампы на 30—40 мин.

Чаще всего заражают эмбрионы в аллантоисную полость. Скорлупу со стороны пуги дезинфицируют йоди­рованным спиртом или прожигают пламенем спиртового ватного тампона, смазывают 5%-ным раствором йода, стерильной иглой прокалывают скорлупу и через это

Рис. 15. Заражение куриных эмбрионов в аллантоисную полость:

/ — воздушная камера; 2 — желточный мешок; 3 — белок; 4 и 6 — хориоаллантоисная полость; 5 — зародыш.

отверстие из шприца с иглой вво­дят в аллантоисную полость ма­териал, используемый для зараже­ния (рис. 15). Затем с помощью пастеровской пипетки заливают отверстие расплавленным парафи­ном или заклеивают лейкопласты­рем.

Зараженных эмбрионов поме­щают в термостат при температуре 36—37, 5°С. Сюда же ставят кю­вет с водой для поддержания влажности в термостате. Длитель­ность инкубирования эмбрионов зависит от характера вируса. Из­менения можно обнаружить, как правило, уже к 48—96-му часу. За­раженные эмбрионы ежедневно осматривают, овоскопируют, поворачивая каждый раз другой стороной. Погибших эмбрионов сразу же вскры­вают или сохраняют при температуре 4°С.

Вскрытие погибших эмбрионов. Скорлупу дезинфи­цируют спиртом и настойкой йода и срезают ножницами по границе пуги. Разрезают скорлуповую и хориоал- лантоисную оболочки и стерильной пастеровской пипет­кой отсасывают в пробирку аллантоисную жидкость; Содержимое яйца выливают в чашку Петри и изучают изменения. Чаще их обнаруживают в оболочках эмбрио­на. Вирусы оспы кур и голубей, болезни Ауески и другие вызывают образование в хориоаллантоисной оболочке < 4> спалительных очагов округлой формы различных размеров. При заражении вирусов болезни Ньюкасла отмечают кровоизлияния в теле эмбриона.

Культивирование клеток куриных фибробластов (КФ) и техника их заражения. При диагностике вирусных болезней и для производства вакцин и диагностикумов* используют различные культуры клеток, в частности однослойные первичные культуры. Их получают из орга­нов и тканей животных и выращивают в питательных

4 -1059
средах на внутренней поверхности стеклянных флаконов (матрасов) или пробирок. Заражение вирусом этих клеток обуславливают его размножение и разрушение клеток— цитопатогенное действие (ЦПД).

Культура фибробластов куриного эмбриона чувстви­тельна ко многим вирусам (болезни Ауэски, чумы плото­ядных, болезни Ньюкасла, ларинготрахеита птиц и др. )> поэтому она широко применяется в вирусологии. Ее готовят на основе выпускаемого отечественной промыш­ленностью сухого ферментативного гидролизата мыхуц (ФГМС).

Для приготовления культуры КФ берут 9—10-днев­ный куриный эмбрион, тупой его конец протирают спир­товым тампоном и прожигают. Верхнюю часть скорлу­пы по окружности вскрывают ножницами и пинцетом извлекают эмбрион на чашки Петри. Голову и лапки удаляют, а тушку переносят в мерный стаканчик (или банку из-под майонеза), разрезают ножницами на кусоч­ки 2—3 мм величиной, промывают дважды раствором Хенкса (в соотношении 1: 20), встряхивая при этом со­держимое. После осаждения ткани надосадочную жид­кость сливают. Ткань заливают в соотношении 1: 10 по­догретым до 35°С раствором трипсина и переливают в коническую колбу. Туда же опускают простерилизо- ванный кипячением цилиндрический магнитик, входящий в комплект магнитной мешалки. Колбу ставят на маг­нитную мешалку и 25—30 мин перемешивают содержи­мое с такой скоростью, чтобы на поверхности жидкости образовывалось воронкообразное углубление. Получен­ную клеточную взвесь, состоящую к этому времени из одиночных клеток, фильтруют через два слоя марли $ разводят в 2 раза свежеприготовленной ростовой сре­дой, состоящей из 0, 25%-ного ФГМС на растворе Эрла (90%) и сыворотки крови крупного рогатого ско­та (10%).

Для определения концентрации клеток берут 1 mJi взвеси, тщательно перемешивают и одну каплю вносят под притертое стекло камеры Горяева. Расчет производят

,                а • 1000

по формуле х = ———, где х — искомое число клеток в

1 мл суспензии; а — число клеток, подсчитанных во всей решетке камеры; 1000 — число мм³ в 1 мл; 0, 9 — объем счетной камеры в мм³.

В соответствии с расчетом суспензию разводят росто­вой средой до концентрации 700—800 тыс. клеток в 1 мл и высевают по 1 мл в пробирки, плотно закрывая их резиновыми пробками (рис. 16). Пробирки размещают на лотках в слегка наклонном положении (под углом 5—7°С) и ставят в термостат при 37°С. Через 24—48 ч в пробирках формируется плотный слой, состоящий из прозрачных фибробластоподобных клеток (монослой, т. е. слой в одну клетку толщиной). Такие культуры КФ готовы для использования в вирусологических це­лях^

Заражают культуры КФ суспензией органов иссле­дуемого животного (или вирусом), которую готовят пу­тем растирания кусочков органов в фарфоровой ступке до П/олучения пастообразной массы. Ее заливают раство­ром Хенкса (1: 10), тщательно перемешивают, добав­ляют пенициллин и стрептомицин каждого по 1000 ЕД на 1 мл.

Из подготовленных пробирок с культурами клеток сливают ростовую среду, вносят в них по 1 мл тканевой суспензии. Чтобы вирус адсорбировался на клетках, пробирки ставят в термостат на 30 мин. Затем иссле­дуемый материал сливают, культуры в пробирках спо­ласкивают раствором Хенкса в объеме 1 мл, затем зали­вают таким же объемом свежей ростовой среды и вновь помещают в термостат.

Просмотр культур (под микроскопом) производят через каждые 24 ч, сравнивая с контрольными незара- женными культурами. По мере необходимости меняют питательную среду на свежую. ЦПД проявляется, в за­висимости от вида вируса, на 1—3 сут, иногда и б более поздние сроки.

Контрольные вопросы к разделу «Основы микробиологии».

1. В чем состоят меры личной профилактики при работе с патологи­ческим материалом, культурами микроорганизмов и животными, больными инфекционными болезнями? 2. Перечислите инфекционные болезни, которыми человек может заразиться от животных. 3. Рас­скажите устройство микроскопа и правила работы с ним. 4. Как при­готовить и окрасить мазки из патологического материала, из культуры микроорганизмов? 5. Какие вы знаете питательные среды, способы их приготовления? 6. Расскажите о технике посевов и пересевов микро­организмов, получении чистых культур. 7. В чем отличие культивиро­вания вирусов от бактерий?

Раздел второй

Основы общей эпизоотологии

Занятие 10. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Задание. 1. Приготовить экстракт (преципитинаген) горячим способом.

2. Профильтровать приготовленный экстракт и пре- ципитирующую сыворотку.

3. Поставить реакцию преципитации методом наслаи­вания и подслаивания.

Основное оборудование и материалы. Кусочки кожи (от незаразного трупа). Физраствор в колбах, мерные пипетки по 1 мл, пастеровские пипетки, сибиреязвенная преципитирующая и нормальная (лошади­ная) сыворотки, асбестовая вата, бактериологические пробирки, ма­ленькие воронки, преципитационные пробирки, штативы, сибиреязвен­ный антиген для контроля, спиртовые или газовые горелки, водяные бани, фарфоровые ступки с пестиками, стерильный песок.

Место занятия. Лаборатория техникума (при наличии в районе ко­жевенного завода можно провести занятия в лаборатории Асколи).

Методика проведения занятия. Преподаватель кратко излагает сущ­ность реакции преципитации и цель ее применения, объясняет и пока­зывает технику постановки реакции.

Каждый учащийся самостоятельно готовит преципитиноген п^тем кипячения кусочков кожи, фильтрует полученный экстракт и прец'ипи- тирующую сыворотку, ставит реакцию преципитации методом наслаива­ния и подслаивания с приготовленным экстрактом, а также контроль реакции, описывает и зарисовывает ход и результаты исследования.

Реакция преципитации основана на взаимодействии двух прозрачных жидкостей, одна из которых содержит антиген (преципитиноген), другая — антитело (преци- питин). При наличии двух специфических компонентов происходит их соединение и на границе жидкостей обра­зуется преципитат в виде беловатого диска (кольца).

В ветеринарной практике реакцию преципитации ста­вят при исследовании материала на сибирскую язву (ко­жи, шерсть, паренхиматозные органы, последние осо­бенно в стадии загнивания). Реакцию можно ставить горячим или холодным способами. Разница между ними состоит в приготовлении антигена. Все компоненты, вхо­дящие в реакцию, должны быть совершенно прозрачны. В связи с этим необходима фильтрация антигена и сы­воротки.

Присланные на исследование пробы патологического материала перед постановкой реакции стерилизуют в автоклаве.

Приготовление компонентов. Для при­готовления преципитиногена присланный кусочек кожи измельчают; 1 г измельченной кожи кипятят в 10 мл физраствора (в пробирке) 30—40 мин в водяной бане (горячий способ) или растирают в ступке с песком, за­ливают 0, 3%-ным карболизированным физраствором в отношении 1: 10 и настаивают 16—18 ч при комнатной температуре (холодный способ). После этого экстракты фильтруют до полной прозрачности через асбестовую вату.

Преципитирующую сибиреязвенную сыворотку гото­вят на биофабриках. Непосредственно перед постановкой реакции ее следует профильтровать.

Постановка реакции. Реакцию преципитации ставят методом наслаивания или подслаивания. Для пос­тановки реакции используют чисто вымытые, прозрач­ные сухие преципитационные пробирки (улленгутовские) размером: длина 5—7 см, диаметр 0, 5—0, 6 см.

Мерной пипеткой, а при массовых исследованиях — пипеткой Флоринского (см. занятие 11), наливают в про­бирки по 0, 2—0, 3 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки. После этого пастеровской пипеткой осторож- нр по стенке наслаивают на сыворотку испытуемый экст­ракт в таком же количестве, как и сыворотку. Затем пробирку ставят в штатив. При использовании метода подслаивания в пробирку наливают 0, 2—0, 3 мл исполь­зуемого экстракта, после этого пастеровской пипеткой осторожно (опустив ее на дно пробирки) подслаивают преципитирующую сыворотку в таком же количестве.

Реакцию оценивают путем просмотра пробирок на темном фоне при проходящем свете. Реакция считается положительной, если в течение первых 15 мин с момента постановки реакции на границе соприкосновения жид­костей образуется серовато-белый диск (кольцо). Поло­жительную реакцию (ясно выраженное кольцо) отмеча­ют знаком 4-; сомнительную реакцию (нерезкое кольцо) знаком ±; отрицательную реакцию (отсутствие кольца) знаком— (минус).

Непосредственно перед постановкой реакции необхо­димо проверить ее компоненты. Для этого ставят конт- роли:

1) сибиреязвенный антиген+ преципитирующая си­биреязвенная сыворотка — реакция должна быть поло­жительной;

2) сибиреязвенный антиген + нормальная сыворотка лошади — реакция должна быть отрицательной;

3) физраствор + преципитирующая сибиреязвенная сыворотка — реакция должна быть отрицательной.

В настоящее время применяют также реакцию пре­ципитации в агаровом геле (см. занятие 32).

и

Занятие 11. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

Задание. 1. Поставить реакцию агглютинации (РА) с бруцеллезным антигеном (пробирочным спосо­бом) и пластинчатую РА с роз бенгал антигеном (РБП).

2. Изучить способы оценки реакции.

Основное оборудование и материалы. Штативы с агглютинацион- ными пробирками, мерные пипетки объемом 1 и 10 мл, микропи­петки объемом 0, 1 мл, специальные шприцы-полуавтоматы, пастеров­ские пипетки, 0, 5%-ный фенолизированный физраствор, единый бру­целлезный антиген для РА, РСК и РДСК, антиген бруцеллезный цвет­ной для роз бенгал пробы, сыворотки крови для исследования, поло­жительная бруцеллезная и отрицательная сыворотки для контроля, лабораторная аппаратура Флоринского, ванночки, сливные чашки, ме­таллические эмалированные пластинки или израсцовые плитки, карандаши по стеклу, стеклянные палочки, спиртовые или газовые горел­ки.

Набор пробирок для оценки РА в крестах (реакция на +, + Ht, + +-К + + + + и отрицательная). Указанный набор готовит препо­даватель заранее.

Место занятия. Лаборатория техникума, ветеринарная лаборато­рия (серологический отдел).

Методика проведения занятия. Преподаватель излагает сущность реакции агглютинации, указывает для диагностики каких инфе# ционных болезней она применяется в ветеринарной практике, демонст­рирует технику постановки реакции (классическим пробирочным и пластинчатым способами), розлив сыворотки двумя способами (путем последовательного 'разведения и микропипеткой), в т. ч. с помощью лабораторной аппаратуры Флоринского.

Перед постановкой пластинчатой реакции роз бенгал антиген вы­держивают 30—40 мин при комнатной температуре и затем тщатель­но встряхивают. Чтобы показать учащимся положительную реакцию, нужно к нескольким испытуемым пробам сыворотки добавить положи­тельную бруцеллезную сыворотку (1—2 капли на пробирку).

Учащихся разбивают на группы по три человека, они самостоятельно разливают сыворотку, добавляют антиген, ставят контроли реакции. Штативы с пробирками помещают в термостат, учет реакции и демон­страция ее учащимся производится на следующие сутки.

Преподаватель объясняет методы оценки реакции агглютинации. Для этого он использует приготовленный штатив с пробирками, где имеются различные реакции на +, + +, + + +, + + + +, а так­же отрицательная реакция. Учет РБП проводят непосредственно в ходе занятий.

Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном применяют при исследовании сыво­ротки крови у крупного рогатого скота, овец, коз, лоша­дей, свиней, верблюдов, северных оленей. Ее преимуще­ства перед классической реакцией агглютинации состоят в простоте и быстроте выполнения. Дл^юстановки реак^ ции пригодны прозрачные сыворотки, без эритроцитов? Бруцеллезный антиген для пластинчатой РА — это взвесь в буферном растворе клеток Br. abortus штамма № 19, инактивированных нагреванием и фенолом и окрашенных бенгальской розовой в малиново-розовый цвет. При от­сутствии этого антигена можно использовать для заня­тий обычный бруцеллезный антиген для РА и РСК (РДСК).

Ставят реакцию на чистых металлических эма­лированных пластинках или израсцовых плитках с лун­ками при температуре 18—30° С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер испытуемой сы­воротки. В начале работы ставят контроль антигена с не­гативной и позитивной агглютинирующими сыворотка­ми в тех же дозах, а также контроль на спонтанную агглю­тинацию (к 0, 03 мл антигена добавляют 0, 03 мл физ­раствора).

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0, 03 мл вносят на дно лунки при помощи специального шприца-полуав- томата или микропипетки. При исследовании сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней в каждую лунку рядом с сывороткой вносят пипеткой 0, 03 мл (две капли) антигена, а при исследовании сыво­ротки крови овец, коз и северных оленей — 0, 015 мл (одну каплю). Затем антиген тщательно смешивают с каждой каплей сыворотки активными движениями до по­лучения однородной смеси, распределяя ее при этом по всей поверхности лунок. Пластину покачивают 4 мин, затем учитывают реакцию, слегка наклонив пластину. Агглютинацию, которая происходит позже, не учитывают.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антиге­на в виде хлопьев розового цвета на белом фоне лункт Если смесь остается гомогенной (агглютинация отсутст­вует) — реакцию считают отрицательной.

Сомнительная

Отрицательная

Сомнительная Отрицательная

Отрицательная Не исследуется

Все сыворотки, с которыми получена положительная РБП в тот же или на другой день исследуют в РА и РСК (РДСК). Оценку «сомнительная» дают только при поло­жительной РБП и отрицательных РА и РСК. Во всех остальных случаях результаты оценивают как положи­тельные (табл. 3).

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: