Описание микроскопа и работы с ним. 5 страница

Результаты реакций			Диагностическая ^
РБП	РА	РСК (РДСК)	оценка

3. Учет реакции агглютинации с роз бенгал антигеном

Положительная Положительная

Положительная Сомнительная Отрицательная Положительная Сомнительная Отрицательная Положительная Сомнительная Отрицательная Не исследуется

П о л о ж и те л ь н а я

 

Сыворотки крови, с которыми в РБП получен отри­цательный результат дополнительно путем РА и РСК не исследуют. Животных, давших сомнительную реакцию* повторно исследуют РБП, РА и РСК (РДСК) через 15—30 дней. В случае положительного или сомнитель­ного результата при повторном исследовании сывороток диагностическая оценка считается положительной,    _v

Реакция агглютинации основана на взаимодействии бактерийных клеток (агглютиногены) и антител (агглю­тинины). Различают две фазы реакции: ! ) невидимая — при которой происходит склеивание бактерийных клеток под действием антител, содержащихся в сыворотке; 2) видимая — выпаденйе склеившихся бактерий в осадок (агглютинат) под влиянием электролитов (поваренная соль).

В ветеринарной практике РА применяется для диаг­ностики бруцеллеза и других болезней. Существует несколько методов постановки РА. Наиболее распрост­раненным является классический, или пробирочный, ме­тод.

Для пробирочного метода РА при исследовании сы­воротки крови крупного рогатого скота необходимо сле­дующее: 1) испытуемые сыворотки крови (правила взя­тия крови у сельскохозяйственных животных для иссле­дования описаны в занятие 28), 2) единый бруцеллез­ный антиген для РА, РСК (РДСК), изготовленный на биофабрике, 3) положительная бруцеллезная агглютини­рующая сыворотка, 4) отрицательная сыворотка, 5) фе- но^шзированный (до 0, 5%) физиологический (0, 85%-ный) раствор, 6) пробирки в штативах, 7) мерные пипетки в 1, 5, 10 мл.

Техника постановки реакции. В штативе устанавливают обычные или агглютинационные пробир­ки. Реакцию ставят в объеме 1 мл. На каждую пробу сы­воротки нужно брать 4 пробирки, так как РА ставят для крупного рогатого скота в разведениях 1: 50, 1: 100, 1: 200 и 1: 400 (при массовых исследованиях допуска­ется постановка реакции в двух разведениях 1: 50 и 1: 100).

Кроме того ставят три контроля: 1) нормальная сыво­ротка в тех же разведениях, что и испытуемая; 2) по­ложительная бруцеллезная сыворотка до предельного ее титра (титром агглютинационной сыворотки называет­ся наибольшее разведение сыворотки, которое вызывает агглютинацию специфического антигена); агглютини­рующие бруцеллезные сыворотки, выпускаемые биофаб­риками, имеют титр 1: 600—1: 800; 3) антиген с 1 мл физраствора.

Разливают сыворотки разными способами, один из которых выглядит следующим образом (рис. 17). В пер- з^ю пробирку наливают 2, 4 мл физраствора, в после­дующие пробирки по 1 мл. Мерной пипеткой (в 1 мл) бе­рут 0, 1 мл испытуемой сыворотки и вносят ее в первую пробирку, тщательно перемешивают. Таким образом, в первой пробирке получается разведение сыворотки 1: 25. Этой же пипеткой 1 мл жидкости переносят из первой про­бирки в пробирку № 2, а из пробирки № 1 выливают 0, 5 мл жидкости в сливную чашку (т. к. реакция агглютина­ции ставится в объеме 1 мл). Из пробирки № 2 (где по-

ЛШтт_н^05мл_ _                                                             _0_±0Вмл

 

	< N1				«1
					>
	1 1	\	1 1		|
*		*		А		f
			У

10//Л смеси

В слиВную чашкц

(0, 5мл [смеси В слиВную > чашку § I I Физраствор

 

РазВвдемия сыВоротки

1. 15

7: 50

1 '100

1: 100

Рис. 17. Схема постановки классической реакции агглютинации. Последовательность розлива компонентов.

 

лучилось разведение сыворотки 1: 50) после смешивания переносят 1 мл жидкости в пробирку № 3 (разведе­ние 1: 100) и оттуда 1 мл в пробирку № 4 (разведение 1: 200).

Из пробирки № 4 1 мл жидкости выливают в слив­ную чашку. Таким же образом (но отдельными пи­петками) производится розлив положительной бруцел­лезной и отрицательной сывороток. После розлива сыво­ротки во все пробирки добавляют мерной пипеткой по 0, 05 мл бруцеллезного антигена для РА (пипеткой, объемом в 1 мл по одной капле).

Штативы с пробирками тщательно встряхивают и по­мещают на 16-—20 ч в термостат при температуре 37—38° С, затем выдерживают при комнатной темпера­туре в течение часа и производят читку реакции. г

Учет реакции начинают с контроля. Реакция шла правильно, если в контроле с физраствором и нор­мальной сывороткой получен отрицательный результат, а в пробирке с агглютинирующей бруцеллезной сыворот­кой — положительная реакция. Реакцию оценивают по степени разведения и по характеру просветления и осадка (в крестах). Положительной реакцией агглютинации на бруцеллез считают для крупного рогатого скота 1: 100

и выше с оценкой не менее, чем на 2 креста; сомнитель­ной — считают реакцию агглютинации в разведении 1: 50.

Оценка РА в крестах. Четыре креста (+ + + +) —полное просветление жидкости при нали­чии ясно выраженного зонтика (осадка). При встряхи­вании осадок разбивается на хлопья, комочки, крупинки (рис. 18).

Три креста (+ + +) — то же, что и в предыдущем ^лучае, но жидкость в пробирке слегка опалесцирует (недостаточно полное просветление жидкости).

Два креста (++) —просветление жидкости выра­жено слабо, имеется зонтик, который при встряхивании разбивается на хлопья, комочки, крупинки (зонтик менее четко сформирован, чем в реакциях на четыре и три креста).

Один крест ( + ) —просветление жидкости отсутст­вует или весьма незначительное. Зонтик выражен слабо или имеются его следы. При встряхивании в жидкости заметны крупинки, комочки.

Знак ( —) означает отрицательную реакцию, при этом просветление и зонтик отсутствуют. Микробы могут осе­дать на дно пробирки в виде точки (пункта), при встря­хивании осадок легко разбивается в равномерную муть (может вначале подниматься небольшой косичкой).

	1ЯИЁ |Ян-Я
Иг			mm			Г ]
						й.
					'■ ■ i^. h

Рис. 18. Оценка реакции агглютинации: а — положительная реакция — наличие зонтика, просветление жидкости; б — положительная реакция — зонтик при встряхи­вании разбивается на хлопья; в — отрицательная реакция — равномерное помутнение.

Замятие П. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ! СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Задание. 1. Ознакомиться с подготовкой компонен­тов для постановки РСК.

2. Провести титрацию компонентов: гемолизина и комплемента в гемолитической и бактериолитической системах.

3. Поставить главный опыт.

4. Научиться оценивать результаты РСК.

Основное оборудование и материалы: гемолизин, антиген для РСК, испытуемые, позитивные и нормальные сыворотки, комплемент, взвесь эритроцитов (2, 5% от осадка), физиологический (0, 85%-йый) раствор химически чистой поваренной соли в дистиллированной воде, водяная баня, холодильник, центрифуга, весы для центрифужных пробирок, ' весы аналитические с разновесом, сушильный шкаф, пробирки, мер­ные пипетки в 1, 5, 10 и 20 мл; колбы, мензурки, измерительные ци­линдры, фильтровальная бумага, штативы для пробирок, карандаши по стеклу.

Место занятия. Лаборатория техникума, серологический отдел ветеринарной лаборатории.

Методика проведения занятия. Преподаватель объясняет сущность реакции, указывает при диагностике каких инфекционных болезней эта реакция применяется, показывает технику постановки реакции (этапы, последовательность), объясняет правила оценки результатов реакции (демонстрация заранее приготовленных пробирок с наличием гемо­лиза и с задержкой гемолиза или объяснение по таблице, плакату).

Затем учащихся распределяют на группы по 3 человека. Они са­мостоятельно ставят реакцию. Окончательный учет результатов можно провести на следующий день (на очередном занятии).

Реакция связывания комплемента (РСК) в настоящее время широко применяется при диагностике целого ряда инфекционных болезней животных вирусного (ящур, чума крупного рогатого скота, болезнь Тешена, катараль­ная лихорадка овец и др. ) и бактериального (сап, бру­целлез, чума верблюдов и др. ) происхождения. Эта реак­ция может быть применена как для выявления специфи­ческих антител, так и для обнаружения специфическо­го антигена.

Сущность реакции состоит в том, что при добавле­нии к сыворотке, содержащей антитела против данного микроорганизма, специфического антигена, а затем ком­племента при определенных количественных соотноше­ниях происходит соединение этих трех компонентов. Последнее выявляется при добавлении к первой (бак­териолитической) системе второй (гемолитической) си-
етемы, состоящей из гемолизина и эритроцитов барана. При отсутствии специфических или при наличии неспе­цифических антител к примененному в реакции антиге­ну гемолиз произойдет, потому что комплемент, не свя­занный в первой системе, соединится с гемолизином во второй системе (табл. 4).

4. Общая схема PC К

 

Больное животное

Здоровое животное

_#. Компоненты и этапы постановки РСК

 

Бактериолитическая система

Инактивированная сы­воротка крови Комплемент (сыворотка крови морской свинки) Специфический антиген 20 мин при 37°С

Имеются специфи­ческие антитела

Комплемент

Антиген

Антиген и антитело связываются и фикси­руют комплемент

Специфических антител нет Комплемент

Антиген Антиген и ан­титело не связы­ваются, комп­лемент свобод­ный

Прибавляется гемолити­ческая система

Гемолизин (инактивиро­ванная гемолитическая сыворотка) Эритроциты барана 20 мин при 37°С

Результат Заключение

Гемолизин

Эритроциты Комплемент, свя­занный со специфи­ческими антителами и антигеном, не всту­пает в соединение с компонентами гемоли­тической системы

Гемолиз отсутствует Животное больное

Гемолизин

Эритроциты Комплеме нт свободный, т. к. специфические антитела отсут­ствуют, он всту­пил в связь с гемолитической системой

Гемолиз есть Животное здо­ровое

 

Для постановки РСК требуются: 1) испытуемая, по­зитивная и нормальная сыворотки; 2) антиген (бруцел­лезный, сапной, ящурный и др. ); 3) комплемент (све­жая консервированная или сухая сыворотка крови морс­кой свинки); 4) гемолизин (с титром не ниже 1: 1000); 5) эритроциты барана (2, 5-ная взвесь от осадка или разведение 1: 40); 6) физиологический раствор (0, 85%-

ный раствор химически чистой поваренной соли в дисти­ллированной воде). Перед постановкой реакции готовят основные разведения компонентов (1: 10, 1: 100). Иссле­дуемые, позитивные и нормальные сыворотки крови раз­водят 1: 10 физраствором и подвергают инактивации пу­тем нагревания на водяной бане при температуре 58— 59°С 30 мин в день постановки РСК.

Перед постановкой РСК гемолизин, антиген и комп­лемент титруют в гемолитической и бактериолитической системах, чтобы определить их разведение (дозу), тре­буемое для постановки реакции. Реакция производится в водяной бане в общем объеме 2, 5 мл всех компонен­тов при температуре 37—38°С.

Техника постановки РСК. Титрация гемо­лизина производится для выявления предельной гемоли- зирующей способности препарата при определенных условиях (время, температура, наличие комплемента и взвеси эритроцитов в определенных количествах). При титрации гемолизина последний является переменной величиной, остальные компоненты и условия реакции — постоянными. Титром гемолизина называют наименьшее количество его, необходимое для полного гемолиза 0, 5 мл 2, 5%-ной взвеси эритроцитов с комплементом в 0, 5 мл разведения 1: 20 при температуре 37—38°С в течение 10 мин. Сначала делают основное разведение 1: 100 (0, 1 мл гемолизина 4-9, 9 мл физраствора}^. Если гемолизин консервирован глицерином, то берут 0, 2 мл гемолизина и 9, 8 мл физраствора. Затем из основного разведения делают разведения 1: 500, 1: 1000 и т. д. Б пробирки вносят по 0, 5 мл требуемого разведения, добавляют по 0, 5 мл комплемента в разведении 1: 20, по 1 мл физраствора и по 0, 5 мл взвеси эритроцитов, встряхивают, ставят в водяную баню при 37—38°С на 10 мин, затем вынимают и учитывают результат (табл. 5).

При титровании гемолизина ставят три контроля: 1) контроль гемолизина (гемолизин 1: 100 + эритроци- ты +физраствор до объема в 2, 5 мл при отсутствии комплемента); 2) контроль комплемента (комплемент+ + эритроциты + физиологический раствор до объема в 2, 5 мл при отсутствии гемолизина); 3) контроль физраст­вора (эритроцитыфизраствор до объема в 2, 5 мл при отсутствии гемолизина и комплемента). Во всех конт­рольных пробирках гемолиза не должно быть (реакция отрицательная).

Таким образом, в приведенном в таблице 5 примере полный гемолиз наступил в пробирке с разведением ге­молизина 1: 2000, в более высоких разведениях гемолиз лишь частичный или отсутствует. Следовательно титр гемолизина будет 1: 2000. Для дальнейших титраций и постановки главного опыта берут удвоенный (т. н. ра­бочий). титр. В данном случае рабочий титр гемоли­зина будет 1: 1000.

Тит рация комплемента в гемолитической системе про­изводится для того, чтобы определить то наименьшее количество, которое необходимо для полного гемолиза 0, 5 мл взвеси эритроцитов при рабочей дозе гемолизина в течение 10 мин на водяной бане при температуре 37— 38°С, т. е. титр комплемента (табл. 6). Комплемент, в разведении 1: 20 разливают в ряд пробирок в дозах 0, 1; 0, 13; 0, 16; 0, 19 и т. д. (с интервалами по 0, 03 мл). Затем в каждую пробирку доливают до объема 0, 5 мл недо­стающее количество физраствора (в первую — 0, 4, во вторую — 0, 37 и т. д. ). После этого в каждую пробир­ку вносят по 0, 5 мл гемолизина в рабочем титре и эритро­цитов (в разведении 1: 40). Затем в пробирки добавляют по 1 мл физраствора. После встряхивания пробирки по­мещают на водяную баню при температуре 37—38°С на 10 мин и производят учет результатов. Одновременно ставят контроли компонентов в смеси с эритроцитами (контроль гемолизина, комплемента, физраствора), а также контроль гемолитической системы при максималь­ной дозе комплемента (см. табл. 6).

В этом примере титр комплемента равен 0, 31, т. к. это наименьшее его количество, которое вызвало гемо­лиз эритроцитов при данных условиях.

Титрация комплемента в бактериолитической системе производится для установления окончательной его дозы в присутствии сыворотки и антигена. Для этого берут две позитивные и две нормальные сыворотки крови, инактивируют их перед постановкой реакции при 58-⁴ 59°С 30 мин. Рабочий титр антигена обозначен на этикет­ке, его проверяют только путем постановки на него конт­роля. Сыворотки разводят 1: 10 и разливают по 0, 5 мл. Разведение комплемента (из основного разведения 1: 20) начинают на два интервала ниже против титра в гемоли­тической системе. В нашем примере титр комплемента 0, 31, следовательно, разведение надо начинать с 0, 25 (а дальше 0, 28; 0, 31; 0, 34 и т. д. ). Каждое разведение

в. Схема титрации комплемента в гемолитической системе Комплемент 1: 20 0, 1 0, 13 0, 16 0, 19 0, 22 0, 25 0, 28 Недостающее количество             физраствора 0, 4 0, 37 0, 34 0, 31 0, 28 0, 25 0, 22 Гемолизин в рабочем титре 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 Эритроциты 1: 40 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 Физраствор 1, 0 1, 0 1, 0 1, 0 1, 0 1, 0 1, 0 t* Водяная баня 10 мин при 37—38° С     Результат НГ ЧГ ЧГ ЧГ ЧГ ЧГ ЧГ

 

 

Продолжение Комплемент 1: 20 0, 31 0, 34 0, 37 0, 40 0, 43 0, 46 0, 49 Недостающее количество             физраствора 0, 19 0, 16 0, 13 0, 1 0, 07 0, 04 0, 01 Гемолизин в рабочем титре 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 Эритроциты 1: 40 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 Физраствор 1, 0 1, 0 1, 0 1, 0 1, 0 1, 0   Водяная баня 10 м, ин при 37—38° С     Результат Г г г г г г г Титр комплемента равен 0, 31.

 

комплемента ставят с контролем — без антигена. Во все пробирки добавляют до 0, 5 мл дозы комплемента физ­раствор. Пробирки встряхивают и ставят на 20 мин в во­дяную баню при 37—38°С.

* Затем в них разливают по 0, 5 мл гемолизина в ра­бочем титре и взвесь эритроцитов или же смесь гемоли­зина и эритроцитов по 1 мл. Пробирки ставят в водяную баню на 20 мин, после чего учитывают результат.

• Титром комплемента в бактериолитической системе является минимальное его количество, обусловливающее полный гемолиз 0, 5 мл взвеси эритроцитов с нормаль­ными сыворотками с антигеном и без антигена, в про­бирках с позитивной сывороткой — без антигена, и не вызывающее гемолиз в пробирках с позитивной сыво­роткой с антигеном. В таблице 7 показана схема титра­ции с одной сывороткой. Аналогичным образом титру­ют комплемент и с остальными сыворотками.

Постановка главного опыта. Для главного опыта

5—1059

g 7. Схема титрации Комплемента в бактериолитической системе

 

1, 0  0, 5 —   0, 5 0, 25 0, 28 0, 25 0, 22

0, 5 0, 5 0, 25 0, 25

Сыворотка 1: 10 Антиген в титре Комплемент 1: 20 Физраствор

1, 0 0, 5  1, 0 0, 5    1, 0

— 0, 5 —    0, 5

0, 28 0, 31 0, 31 0, 34 0, 34

1, 0 0, 43 0, 07

0, 5 0, 5 0, 43 0, 07

1, 0 0, 40 0, 1

0, 5 0, 5 0, 40 0, 1

1, 0 0, 37 0, 13

0, 5 0, 5 0, 37 0, 13

0, 22 0, 19 0, 19 0, 16 0, 16

 

Водяная баня 20 мин при 37—38° С

Гемолизин в рабочем титре по 0, 5 мл в каждую пробирку Эритроциты в разведении 1: 40 по 0, 5 мл в каждую пробирку

Водяная баня 20 мин при 37—38° С

Результаты:

+ + + —

I + + + +   =~

^ 8. Примерная схема главного опыта   Р*--------------------------------------------------------------------------------------- Номер испытуемой сыворотки   * 1 *     Контрол и   Контроль 1 позитивной сыворотки 1 Контроль нормальной сыворотки анти­гена эритро­цитов гемоли­зина Доза сыворотки 0, 05 0, 1 0, 05 0, 1 0, 05 0, 1 0, 05 0, 1 0, 05 0, 1 0, 05 0, 1 ___ __ ___ Физраствор 0, 45 0, 9 0, 45 0, 9 0, 45 0, 9 0, 45 0, 9 0, 45 0, 9 0, 45 0, 9 — 2, 0 1, 0         Водяная баня 30 мин при 58—59° С             Антиген в рабочем титре 0, 5 — 0, 5 — 0, 5 — 0, 5 — 0, 5 — 0, 5   1, 0 — — Комплемент в рабо­чем титре 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 — 0, 5         Водяная баня 20 мин при 37—38° С             Гемолизин в рабочем положении 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5   0, 5 Эритроциты (1: 40) 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5         Водяная баня 20 мин при 37—38° С             Результат + + + + -   - + - - - + + + + - _ _ - + + + + _ В приведенном примере животное № 1 — больное, животные № 2 и № 3 — сомнительно реагирующие, животное № 4 — здоровое. О) ■ ч

на позитивной сыворотке + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + на нормальной сыворотке +++++++ + + + ++ + + + Титр комплемента 0, 37

компле! мент разводят следующим образом. Расчет про­изводят на 100 пробирок. В нашем примере титр комп­лемента в бактериолитической системе составил 0, 37 в разведении 1: 20. Соответственно в каждой пробирке чистого комплемента 0, 37: 20 = 0, 0185. Для 100 пробирок 0, 0185x100=1, 85 чистого комплемента и 48, 15 физ­раствора.

Реакцию ставят в объеме 2, 5 мл всех компонентов, т. е. каждый компонент берут в объеме 0, 5 мл. Каждую испытуемую сыворотку исследуют в пробирках (с анти­геном и без него). В первую пробирку наливают 0, 05 мл, во вторую — 0, 1 мл сыворотки. Пробирка без антигена служит контролем. Сыворотки в разведении 1: 10 инак- тивируют при 58—59°С перед постановкой опыта. Осталь­ные компоненты добавляют в установленных рабочих титрах (табл. 8). Время связывания в бактериолити­ческой системе 20 мин, с гемолитической системой — 20 мин.

Основные контроли главного опыта: а) нормальные и позитивные сыворотки с антигеном и без него; б) конт­роль эритроцитов и гемолизина.

Оценка результатов РСК производится дважды: первый раз — тотчас после водяной бани, вто­рой раз — через 12 ч выдерживания проб при ком­натной температуре.

Положительная реакция: а) полная задержка гемо­лиза или с наличием гемолиза до 10%, обозначает­ся Ч- + + +; б) гемолиз от 10 до 40%, обозначает­ся + + +.

Сомнительная реакция: а) гемолиз от 40 до 70%, обозначается ++; б) гемолиз от 70 до 90%, обозна­чается -К

Отрицательная реакция: гемолиз от 90 до 100% эри­троцитов, обозначается— (минус). Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, проверяют повторно. Животных, сыворотки крови которых дают сомнительную реакций, повторно исследуют через 2—3 недели.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: