Альтернативные батареи тестов

Одной из основных проблем альтернативного моделирования является выбор правильной стратегии тестирования для новых химических веществ и инновационных лекарств, по которым еще нет данных о потенциальной токсичности их молекул. Только некоторые исследования вносят новые данные в проблему поиска и валидации общепринятых методов. Исследования in vitro позволят сформировать общую стратегию тестирования. Для этого необходима новая техника использования культур клеток, которая обеспечит уровень функционирования системы или органа в целом, что позволит вычленить в in vitro- моделях функциональные свойства in vivo -органа в целостном организме. Общепринятым подходом является использование нескольких параллельных исследований на клеточных культурах, которые условились обозначать как батарею тестов.

Батарея тестов (test battery) представляет собой мультиметодическое использование серии тестов, проводимых обычно в одно и то же время или в тесной связи друг с другом. Каждый тест внутри последовательности строится для получения дополнительной информации от предыдущего и для измерения различий дополнительного многофакторного токсического эффекта.

Определение максимально толерантной дозы in vitro осуществляется на основе определения минимальной концентрации лекарств in vitro, которое приводит к изменениям в клеточной морфологии. Лактатдегидрогеназа (LDH) уменьшает или повышает до 50% смертность клеток (СТ₅₀), что предполагает соответствие этой дозы лекарств дозе in vivo. Она дает повышение до первоначальных или слабых проявлений токсичности, т.е. до тех пор, пока минимальная концентрация лекарств in vitro не приведет к гибели более 90% клеток (СТ₁₀₀) и не будет соответствовать дозе in vivo, которая в свою очередь дает повышение маркированных клинических показателей. Значения СТ₅₀ и СТ₁₀₀ (мг/мл) трансформируются в мг/кг/день для порога in vivo.

Следует подчеркнуть, что первичные культуры гепатоцитов крысы более чувствительны, чем многие другие типы клеток. Они используются для прогнозирования значений in vivo у собак. Клетки MDBK (почки крупного рогатого скота, телят) менее чувствительны и используются для получения прогнозируемых данных in vivo у крыс. Клетки McCoy эпителия человека служат в качестве контроля in vitro. Такие параметры роста и морфологии как площадь поверхности, занятая растущими линиями клеток, изменения в размерах и форме клеток, наличие цитоплазматических вакуолей, деление клеток, гибель и умирающие клетки, учитываются после экспозиции для гепатоцитов – 24 часа, для остальных клеточных линий – 24, 48 и 72 часа. Ниже мы приводим некоторые, наиболее распространенные, батареи тестов для альтернативного моделирования острой токсичности.

Тест А Hep G2 cell/protein content основан на использовании линии клеток гепатомы для тестирования субстанций. Цитотоксичность измеряется как изменение содержания белка по методу, описанному Lowry и др. Тест принят для использования в батарее тестов совместно с тестами B-D (см. ниже) или в комбинации только с тестом B, для уменьшения количества животных в опытах по изучению острой токсичности при применении препаратов per os.

Статус валидации оценен в Multicentre Evaluation of in vitro Cytotoxicity (MEIC – мультицентр по оценке цитотоксичности in vitro) по релевалентности цитотоксичности тестов in vitro для оценки острой токсичности у человека. Результаты MEIC показали соответствие тестов, проведенных на клеточных культурах человека для определения базальной цитотоксичности. В батарею тестов, для улучшения общих результатов моделирования, должны быть включены два вида тестов: тесты in vitro, имеющие соответствие по токсикокинетике и тесты in vitro, целью которых является определение токсичности для органов. Тесты были разработаны для оценки летальных концентраций в крови человека и их, в противовес концентрации в крови, необходимо комбинировать с данными по поглощению в соответствии с предполагаемыми проверяемыми дозами. Тест осуществляется в течение 24 часов.

Тест B HL-60/ATФ content основан на использовании указанных клеток острой миелолейкемии человека для тестирования субстанций. Содержание АТФ измеряют с помощью Lucifer-LU плюс оборудование для биолюминисценции из энзимной люцеферин-люцеферазной реакции. Тест принят для использования в батарее тестов совместно с тестами A, C и D (см. ниже) или в комбинации только с тестом A. Тест разработан и оценен по программе MEIC для определения летальной концентрации в крови человека. Результаты, в противовес концентрациям в крови, должны быть рассмотрены в комбинации с данными по абсорбции в соответствии с прогнозированием управляемых доз. Тест осуществляется в течение 24 часов.

Chang liver cell -тест С основан на использовании клеток печени Chang’а, культивированных в запечатанных парафином чашках с 96 ячейками для микротитрования. Недостаток развития веретенообразных или веретеновидных клеток является критерием цито-ингибирования. Культуры затем культивируются в течение 7 дней и используются в тесте D. Оценен по программе MEIC для использования в батареях тестов A, B и D. Тест разработан для оценки летальной концентрации в крови человека. Результаты должны быть рассмотрены в противовес концентрациям в крови, в комбинации с данными по абсорбции в соответствии с прогнозированием управляемых доз.

Тест D Chang cell/pH основан на использовании культуры из теста С. Через 168 часов цвет рН индикатора фенол красный, включенного в среду, записан. Фиолетовый цвет является показателем полного ингибирования, в то время как наличие небольшого количества основного красного, как и не являющегося нормальным оранжевого цвета говорят о частичном ингибировании. Используется в батареях тестов A, B и С.

Тест Е BALB/c 3T3 (NRU) используется для определения цитотоксичности на изолированных клетках указанной линии мышей для испытания выживания и жизнеспособности, определяемой по способности переживающих клеток окрашиваться нейтральным красным (NRU). NR аккумулируется в лизосомах. Изменения поверхности клетки является результатом снижения поглощения и связывания NR. Тест валидирован и широко распространен. Тест является альтернативой использования животных по определению острой токсичности средств, применяемых per os.

Тест F NRU на линии человеческих кератиноцитов используется для определения цитотоксичности на изолированных клетках человека по показателям выживания и жизнеспособности, определяемой по способности переживающих клеток окрашиваться нейтральным красным (NRU). NR аккумулируется в лизосомах. Тест валидирован, широко распространен и является альтернативой использования животных по определению острой токсичности средств, применяемых per os. Тест осуществляется в течение 48 часов.