Главная | Обратная связь
МегаЛекции

Альтернативные батареи тестов





 

Одной из основных проблем альтернативного моделирования является выбор правильной стратегии тестирования для новых химических веществ и инновационных лекарств, по которым еще нет данных о потенциальной токсичности их молекул. Только некоторые исследования вносят новые данные в проблему поиска и валидации общепринятых методов. Исследования in vitro позволят сформировать общую стратегию тестирования. Для этого необходима новая техника использования культур клеток, которая обеспечит уровень функционирования системы или органа в целом, что позволит вычленить в in vitro-моделях функциональные свойства in vivo-органа в целостном организме. Общепринятым подходом является использование нескольких параллельных исследований на клеточных культурах, которые условились обозначать как батарею тестов.

Батарея тестов (test battery) представляет собой мультиметодическое использование серии тестов, проводимых обычно в одно и то же время или в тесной связи друг с другом. Каждый тест внутри последовательности строится для получения дополнительной информации от предыдущего и для измерения различий дополнительного многофакторного токсического эффекта.

Определение максимально толерантной дозы in vitro осуществляется на основе определения минимальной концентрации лекарств in vitro, которое приводит к изменениям в клеточной морфологии. Лактатдегидрогеназа (LDH) уменьшает или повышает до 50% смертность клеток (СТ50), что предполагает соответствие этой дозы лекарств дозе in vivo. Она дает повышение до первоначальных или слабых проявлений токсичности, т.е. до тех пор, пока минимальная концентрация лекарств in vitro не приведет к гибели более 90% клеток (СТ100) и не будет соответствовать дозе in vivo, которая в свою очередь дает повышение маркированных клинических показателей. Значения СТ50 и СТ100 (мг/мл) трансформируются в мг/кг/день для порога in vivo.

Следует подчеркнуть, что первичные культуры гепатоцитов крысы более чувствительны, чем многие другие типы клеток. Они используются для прогнозирования значений in vivo у собак. Клетки MDBK (почки крупного рогатого скота, телят) менее чувствительны и используются для получения прогнозируемых данных in vivo у крыс. Клетки McCoy эпителия человека служат в качестве контроля in vitro. Такие параметры роста и морфологии как площадь поверхности, занятая растущими линиями клеток, изменения в размерах и форме клеток, наличие цитоплазматических вакуолей, деление клеток, гибель и умирающие клетки, учитываются после экспозиции для гепатоцитов – 24 часа, для остальных клеточных линий – 24, 48 и 72 часа. Ниже мы приводим некоторые, наиболее распространенные, батареи тестов для альтернативного моделирования острой токсичности.



Тест А Hep G2 cell/protein content основан на использовании линии клеток гепатомы для тестирования субстанций. Цитотоксичность измеряется как изменение содержания белка по методу, описанному Lowry и др. Тест принят для использования в батарее тестов совместно с тестамиB-D (см. ниже) или в комбинации только с тестом B, для уменьшения количества животных в опытах по изучению острой токсичности при применении препаратов per os.

Статус валидации оценен в Multicentre Evaluation of in vitro Cytotoxicity (MEIC – мультицентр по оценке цитотоксичности in vitro) по релевалентности цитотоксичности тестов in vitro для оценки острой токсичности у человека. Результаты MEIC показали соответствие тестов, проведенных на клеточных культурах человека для определения базальной цитотоксичности. В батарею тестов, для улучшения общих результатов моделирования, должны быть включены два вида тестов: тесты in vitro, имеющие соответствие по токсикокинетике и тесты in vitro, целью которых является определение токсичности для органов. Тесты были разработаны для оценки летальных концентраций в крови человека и их, в противовес концентрации в крови, необходимо комбинировать с данными по поглощению в соответствии с предполагаемыми проверяемыми дозами. Тест осуществляется в течение 24 часов.

Тест B HL-60/ATФ content основан на использовании указанных клеток острой миелолейкемии человека для тестирования субстанций. Содержание АТФ измеряют с помощью Lucifer-LU плюс оборудование для биолюминисценции из энзимной люцеферин-люцеферазной реакции. Тест принят для использования в батарее тестов совместно с тестамиA, CиD (см. ниже) или в комбинации только с тестом A. Тест разработан и оценен по программе MEIC для определения летальной концентрации в крови человека. Результаты, в противовес концентрациям в крови, должны быть рассмотрены в комбинации с данными по абсорбции в соответствии с прогнозированием управляемых доз. Тест осуществляется в течение 24 часов.

Chang liver cell-тест С основан на использовании клеток печени Chang’а, культивированных в запечатанных парафином чашках с 96 ячейками для микротитрования. Недостаток развития веретенообразных или веретеновидных клеток является критерием цито-ингибирования. Культуры затем культивируются в течение 7 дней и используются в тесте D. Оценен по программе MEIC для использования в батареях тестов A, B и D. Тест разработан для оценки летальной концентрации в крови человека. Результаты должны быть рассмотрены в противовес концентрациям в крови, в комбинации с данными по абсорбции в соответствии с прогнозированием управляемых доз.

Тест D Chang cell/pH основан на использовании культуры из теста С. Через 168 часов цвет рН индикатора фенол красный, включенного в среду, записан. Фиолетовый цвет является показателем полного ингибирования, в то время как наличие небольшого количества основного красного, как и не являющегося нормальным оранжевого цвета говорят о частичном ингибировании. Используется в батареях тестов A, B и С.

Тест Е BALB/c 3T3 (NRU) используется для определения цитотоксичности на изолированных клетках указанной линии мышей для испытания выживания и жизнеспособности, определяемой по способности переживающих клеток окрашиваться нейтральным красным (NRU). NR аккумулируется в лизосомах. Изменения поверхности клетки является результатом снижения поглощения и связывания NR. Тест валидирован и широко распространен. Тест является альтернативой использования животных по определению острой токсичности средств, применяемых per os.

Тест F NRU на линии человеческих кератиноцитов используется для определения цитотоксичности на изолированных клетках человека по показателям выживания и жизнеспособности, определяемой по способности переживающих клеток окрашиваться нейтральным красным (NRU). NR аккумулируется в лизосомах. Тест валидирован, широко распространен и является альтернативой использования животных по определению острой токсичности средств, применяемых per os. Тест осуществляется в течение 48 часов.

 





Рекомендуемые страницы:

Воспользуйтесь поиском по сайту:
©2015- 2020 megalektsii.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.