 |
Реакция преципитации в геле по Оухтерлони
|
|
|
|
Для постановки реакции используют 1%-ный агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую — иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно — через 24–48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 10, б).
Рис. 10. Реакция преципитации:
а — реакция кольцепреципитации; б — реакция преципитации по Оухтерлони
Реакция кольцепреципитации
Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1–0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3–5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 10, а). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител.
Метод радиальной иммунодиффузии
Принцип наиболее простого и распространенного метода радиальной иммунодиффузии заключается в оценке диаметра колец преципитации, возникающих при взаимодействии в геле антигена (в данном случае иммуноглобулина исследуемой сыворотки) и антитела (антител к иммуноглобулинам человека, содержащимся в стандартных антисыворотках).
|
|
|
Стандартные антисыворотки с антителами к IgG, IgM, IgA смешивают с расплавленным агаром. Эту смесь заливают на специальные пластины. После ее застывания на каждой пластине специальным пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм (рис. 11, а). В лунки микропипеткой вносят по 2 мкл последовательных разведений (1:1, 1:2,... 1:8) стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов, а также такое же количество разведений исследуемой сыворотки (с неизвестным содержанием иммуноглобулинов).
Рис. 11. Схема определения концентрации иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии:
а — внесение стандартной и исследуемой сыворотки в лунки пластины с залитым агаром, содержащим антитела к иммуноглобулинам; б — фрагмент пластины после инкубации (видны кольца преципитации, диаметр которых зависит от концентрации иммуноглобулинов); в — калибровочная кривая зависимости диаметра колец преципитации от концентрации иммуноглобулинов стандартной сыворотки
Пластины инкубируют при 4 °C в течение 24 ч и затем оценивают результаты. Антиген (иммуноглобулин стандартной или исследуемой сыворотки) диффундирует в слое агара, содержащего антитела к человеческим иммуноглобулинам, в результате чего вокруг лунок образуются кольца преципитации (рис. 11, б). Чем выше концентрация иммуноглобулинов, тем больше диаметр кольца. Вначале оценивают размеры колец преципитации вокруг лунок, в которые были внесены стандартные сыворотки различного разведения с известной концентрацией иммуноглобулинов. По этим результатам строят кривую, отражающую зависимость между диаметром (площадью) кольца преципитации и концентрацией иммуноглобулина (рис. 11, в). Такую кривую строят для каждой пластины. Затем измеряют диаметр колец преципитации в испытуемом препарате и по стандартной калибровочной кривой определяют искомую концентрацию иммуноглобулинов.
|
|
|
Для количественного определения IgE, присутствующего в сыворотке крови в низких концентрациях, применяют более точные методы радиоиммунного или иммуноферментного анализа.
Реакция иммуноэлектрофореза
Используется в основном для определения моноклональных иммуноглобулинов, например парапротеинов при миеломной болезни или макроглобулинемии Вальденстрема. Метод представляет собой сочетание электрофоретического разделения белков сыворотки крови (или других биологических сред) и последующей радиальной иммунодиффузии с образованием преципитатов.
Для проведения реакции расплавленный агар наносят на предметное стекло и делают в нем лунку (рис. 12, a). В лунку вносят исследуемую сыворотку и пластину помещают в электрическое поле, под действием которого происходит разделение различных белков сыворотки крови (рис. 12, б). По окончании электрофореза в агаровой пластине вырезают траншею, в которую вносят стандартную антисыворотку, содержащую антитела к определенным антигенам, например парапротеину (рис. 12, в). Если в исследуемой сыворотке имеются искомые антигены (парапротеин), уже через несколько суток в агаровом слое образуются полосы преципитации (рис. 12, г).
Рис. 12. Схема метода иммуноэлектрофореза:
а — внесение в лунку исследуемой сыворотки с искомым антигеном; б — электрофоретическое разделение белков исследуемой сыворотки; в — внесение в траншею стандартной антисыворотки с антителами к искомому антигену; г — появление дуг преципитации при наличии в исследуемой сыворотке искомого антигена
Метод иммуноэлектрофореза чаще используется для идентификации низких концентраций парапротеина при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема и т.д.
|
|
|
