 |
Определение количества субпопуляций Т-лимфоцитов
|
|
|
|
Принцип метода: моноклональные антитела (мАТ) к поверхностным дифференцировочным антигенам лимфоцитов периферической крови используют для определения их фенотипа и количественного учета. Количество лимфоцитов определенного фенотипа существенно изменяется при вирусных заболеваниях и аутоиммунных патологиях, стрессе. Определение фенотипа лимфоцитов рекомендуется проводить при использования иммуномодуляторов, при наличии клинических признаков иммунологической недостаточности. Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов осуществляется на проточных цитометрах после их специфического связывания с мАТ и окрашивания антиглобулиновыми антителами, меченными флуорохромом или на люминесцентном микроскопе. В настоящее время существует большое количество типов антител к дифференцировочным антигенам лимфоцитов животных. Классификация мАТ базируется на группах мАТ, реагирующих с одними и теми же дифференцировочными антигенами на лимфоцитах человека (CD — cluster of differentiation; CD-номенклатура).
Циркулирующие иммунные комплексы
В последние годы большое диагностическое значение придают определению в сыворотке крови циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Они представляют собой растворимые комплексы антиген-антитело, которые в норме фагоцитируются макрофагами и разрушаются. Для определения ЦИК используют метод осаждения (преципитации) ЦИК раствором полиэтиленгликоля. После инкубации и центрифугирования выпавшие в осадок ЦИК растворяют раствором едкого натра и определяют их содержание в растворе на спектрофотометре, выражая количество иммунных комплексов в единицах оптической плотности. Определение ЦИК в сыворотке крови возможно также с помощью метода иммунофлуоресценции. Увеличение концентрации ЦИК может иметь два важных в практическом отношении следствия.
|
|
|
Во-первых, ЦИК могут приводить к повреждению мембран и способствовать развитию иммунопатологического процесса в органах. Особенно часто это наблюдается при снижении функциональной активности тканевых макрофагов.
Во-вторых, ЦИК обладают способностью активировать систему комплемента, хемотаксическим действием по отношению к лимфоцитам и нейтрофилам, активируют систему свертывания крови, кининовую систему, выделение гранулоцитами и макрофагами биологически активных веществ и т.д. Эти эффекты ЦИК сопровождаются развитием воспаления тканей. Повышение концентрации ЦИК обнаруживают при многих заболеваниях, в основе которых лежат нарушения клеточного иммунитета, в первую очередь при различных аутоиммунных заболеваниях.
Определения фенотипа и количества лимфоцитов с помощью моноклональных антител на лазерном проточном цитометре методом непрямой иммунофлуоресценции
Немеченые мышиные моноклональные антитела (мАТ) к соответствующим поверхностным рецепторам разных популяций лимфоцитов крови человека (животных) после их прикрепления визуализируются добавлением антимышиных иммуноглобулинов, меченных флуоресцентными красителями (например ФИТЦ или фикоэритрином).
Необходимое оборудование:
• мАТ нужной специфичности.
• Лейкоцитарная клеточная взвесь или мононуклеарные клетки крови, выделенные из 3 мл крови.
• Среда 199.
• 1%-ный параформальдегид.
• Фиколл-верографин.
• 70%-ный глицерин.
• Проточный цитофлуориметр.
• Центрифуга на 3000 об/мин.
• Термостат 37 °C.
• Холодильник бытовой (+4 °C).
• Полная рабочая среда (ПРС).
• Лизирующий раствор.
Постановка метода:
1. Производится забор крови из вены в объеме 3 мл с гепарином (из расчета 15–20 единиц на 1 мл крови).
|
|
|
2. Наслаивают на 0,5 мл раствора фиколл-верографина (плотностью 1,077 г/см3) и центрифугируют при 400g 25 мин.
3. Пастеровской пипеткой отбирают лейкоцитарное кольцо и дважды отмывают центрифугированием (200g, 10 мин) в среде 199.
4. Осадок ресуспендируют в среде 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой в объеме 1 мл.
5. С помощью камеры Горяева определяют число ядросодержащих клеток и доводят их концентрацию до 2·106 клеток/мл средой 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой.
6. К осадку клеток добавляют 0,5 мл ПРС, клеточную взвесь разливают по 50 мкл в лунки 96-луночных круглодонных планшетов.
7. В каждую лунку вносят по 50 мкл предварительно разведенных мАТ: первая лунка — контроль (добавляют ПРС), 2-я, 3-я, 4-я, 5-я лунки — мАТ CD3, CD4, CD8, CD21 соответственно.
8. Планшет ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).
9. Клетки дважды отмывают от мАТ путем добавления в каждую лунку по 200 мкл ПРС и центрифугирования планшетов в течение 5 мин при 1000 об/мин.
10. В случае если мАТ не соединены с флуорохромом, проводят процедуру докрашивания, добавляя в каждую лунку по 50 мкл антимышиных иммуноглобулинов, меченых ФИТЦ в соответствующем инструкции разведении.
11. Планшеты ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).
12. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл ПРС и затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин (300g). Надосадочную жидкость из планшета стряхивают резким движением.
13. Лизируют оставшиеся в пробе эритроциты: к осадку добавляют по 200 мкл лизирующего раствора.
14. Встряхивают на шейкере 1 мин, сразу центрифугируют 5 мин при 300g, надосадочную жидкость выливают резким движением.
15. Быстро добавляют ПРС до полного объема лунки, центрифугируют при тех же условиях и сливают надосадочную жидкость.
16. Для фиксации к осадку добавляют по 100 мкл 2%-ного параформальдегида и ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).
17. Добавляют ПРС до полного объема лунки.
Для длительного хранения препаратов слегка увлажняют прокладку из фильтровальной бумаги, закрывают планшет этой бумагой и сверху накрывают крышкой. Планшет помещают в холодильник и затем просчитывают образцы на цитометре.
|
|
|
