 |
Метод радиальной иммунодиффузии (по Манчини)
|
|
|
|
Количество и соотношение иммуноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против антител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация антител везде одинакова, то в результате реакции антиген-антитело в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации антигена в исследуемой жидкости.
В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале.
Используют 3%-ный агар Дифко на веронал-мединаловом буфере pH 7,3–7,4 (мединал — 35,4 г, веронал — 5,25 г, дистиллированная вода — до 1000 мл). В бактериологической пробирке смешивают по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стекла размером 9×12 см, на одно из них помещаю П-образную рамку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки и оставляют в вертикальном положении для застывания агара на 15–20 мин. Затем удаляют одно из стекол и рамку.
В агаре пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч ( IgG, IgA) или 48 ч (IgM).
|
|
|
Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной стандартной сыворотки, на оси ординат — значения концентраций иммуноглобулинов (% или мг/мл). Измеряют диаметр колец преципитации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают концентрацию соответствующего иммуноглобулина.
Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК) проводится с участием не только антигена и антитела, но и комплемента. Так как она не сопровождается видимыми изменениями, для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика. В присутствии комплемента в гемолитической сыворотке происходит хорошо наблюдаемый лизис эритроцитов. Принцип метода состоит в том, что если в опыте образовался комплекс антиген-антитело и с ним связался комплемент (т.е. в растворе свободного комплемента не останется), то лизиса эритроцитов не произойдет и они осядут на дно пробирки. Если комплекс не формируется, то комплемент остается свободным и реагирует с гемолитической системой, вызывая лизис эритроцитов. Этот механизм лежит в основе реакции Вассермана (диагностика сифилиса).Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по реакции связывания комплемента. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей антитела к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиза эритроцитов не происходит в связи с отсутствием важного звена процесса связывания антител с антигеном — комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, образуется иммунный комплекс, и происходит связывание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов.
|
|
|
В норме уровень комплемента сыворотки крови составляет 20–40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических — ее снижение.
Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или приобретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отметить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные аномалии белков человека. Они могут играть патогенетическую роль при следующих заболеваниях и синдромах:
1. Рецидивирующие бактериальные пиогенные инфекции органов дыхания, кожи и других органов: пневмонии, бронхоэктазы, рецидивирующий синусит, пиодермия, генерализованные бактериальные инфекции, септицемия.
2. Рецидивирующие менингококковые и гонококковые инфекции (менингококковый менингит, диссеминированные гонококковые инфекции, гонококковые артриты и др.).
3. Аутоимунные, аллергические заболевания и болезни иммунных комплексов: системная красная волчанка, дерматомиозит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, болезнь Шенлейн-Геноха, синдром Шегрена, тромбоцитопеническая пурпура, склеродермия, ювенильный ревматоидный артрит, рецидивирующий ангионевротический отек (особенно часто — ларингоспазм), дерматозы, фоточувствительность и др.
Реакция связывания комплемента используется для лабораторной диагностики риккетсиозов, вирусных инфекций (грипп, корь, клещевой энцефалит и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ + АТ. Комплемент адсорбируется на Fc-фрагменте иммуноглобулинов G и М.
Реакция протекает в две фазы (рис. 13).
Рис. 13. Реакция связывания комплемента:
а — лизис сенсибилизированных эритроцитов в присутствии комплемента; б — отсутствие гемолиза вследствие фиксации комплемента комплексом АГ+АТ; в — лизис эритроцитов в результате отсутствия комплекса А
|
|
|
Первая фаза — взаимодействие антигена и антитела. В качестве материала, содержащего антитела, используется исследуемая сыворотка, к которой добавляется известный антиген. К этой системе добавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
Вторая фаза — выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолизины к эритроцитам барана). К смеси антиген + антитело + комплемент (1-я фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37 °C в течение 30–60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Разрушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ + АТ, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела к диагностическому антигену. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител комплекс АГ + АТ не образуется и комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Все компоненты РСК, за исключением исследуемой сыворотки, должны быть оттитрованы.
Тесты с ингибированием гемагглютинации эритроцитов
Данные методы не отличаются особой чувствительностью определений, но зато относительно просты в исполнении и нетрудозатратны. Для проведения такого исследования смешивают анализируемый объект с раствором антигена (подозреваемой патологии). Если в испытуемом образце имеются антитела к антигену возбудителя, происходит их комплексообразование, которое в дальнейшем предотвращает агглютинацию эритроцитов под влиянием молекул антигена.
Реакция выполняется на планшетах с лунками с коническим дном, результат (наличие-отсутствие агглютинации) наблюдают непосредственно, т.е. невооруженным глазом. Натренированный человек способен различать даже степени протекания агглютинации. К сожалению, многие гликопротеины, являющиеся антигенами вообще, способны давать реакцию агглютинации эритроцитов, поэтому метод не отличается особой специфичностью.
|
|
|
Метод флуоресцирующих антител для выявления патогенных бактерий и определения антител к ним. Реакция иммунофлуоресценции
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флуоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционноспособные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы антиген - антитело становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом. С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов.
При некоторых заболеваниях внутренних органов, в развитии которых имеет значение процесс иммунного воспаления или иммунной агрессии, в сыворотке крови можно обнаружить аутоантитела к гладкой мускулатуре, эритроцитам, иммуноглобулинам, митохондриям, антиядерные (антинуклеарные) антитела, антитела к ДНК, противоопухолевые антитела и др. Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является метод иммунофлуоресценции, имеющий несколько модификаций и протекающий в два этапа. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап — в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.
Преимущество РИФ — простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.
При прямой иммунофлуоресценции к исследуемому препарату (например срезам тканей), содержащему искомый антиген, добавляют антисыворотку с антителами к этому антигену. Предварительно антитела метят флуорохромом. В результате взаимодействия антигена и антитела образуется иммунный комплекс, который фиксируется только в тех участках ткани, где имеется данный антиген. Эти участки легко обнаруживаются при микроскопии в ультрафиолетовом свете по характерному свечению (флуоресценции).
|
|
|
В клинической практике по понятным причинам чаще используют метод непрямой иммунофлуоресценции. На срезы тканей различных органов животных, содержащих известные антигены, наносится исследуемая сыворотка (рис. 18, а). Если в ней содержатся антитела (иммуноглобулины) к данному тканевому антигену, происходит реакция связывания этих антител антигеном (рис. 18, б). Не связавшиеся белки тщательно отмывают и на срезы тканей наносят противочеловеческую IgG-антисыворотку, меченную флуорохромом (рис. 18, в). В результате антитела с флуорохромной меткой против иммуноглобулинов (например, против IgG), содержащиеся в антисыворотке (антитела к антителам-иммуноглобулинам класса G), связываются только с иммуноглобулинами (антителами), которые присутствовали в исследуемой сыворотке больного и остались фиксированными на соответствующих (известных) антигенах ткани (рис. 18, г). Люминесценция этих фиксированных антител хорошо выявляется при микроскопии ткани в ультрафиолетовом свете.
Таким образом, на первом этапе непрямой иммунофлуоресценции происходит как бы «закрепление» антител больного в тех местах ткани, где локализованы соответствующие антигены (см. рис. 18, а, б), а на втором этапе — их обнаружение с помощью антител сыворотки к этим иммуноглобулинам, меченных флуорохромом (см. рис. 18, в, г).
Рис. 18. Схема метода непрямой иммунофлуоресценции:
а — нанесение исследуемой сыворотки на срезы тканей с известным антигеном; б — реакция связывания антител антигеном; в — внесение стандартной антисыворотки, содержащей антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуорохромом; г — фиксация этих антител на антителах к искомому антигену
Метод иммунофлуоресценции используется для выявления аутоантител к гладкой мускулатуре, митохондриям, антиядерных, антинуклеарных и других антител. Для их обнаружения в сыворотке крови больного обычно используют срезы желудка и почки крыс.
Иммунофлуоресцентное исследование — одна из наиболее простых процедур клинической диагностики (рис. 19). На пленку наносят исследуемый объект (сыворотка крови и т.п.). Образец может содержать, а может и не содержать антигены возбудителя подозреваемой патологии. Для проверки на ту же пленку наносят раствор антител к искомому антигену, конъюгированных (т.е. связанных ковалентно) с молекулами флуоресцирующего соединения, которое в данном случае выступает в роли маркера, удобного для обнаружения. Пленка выдерживается в растворе антител некоторое время, достаточное для связывания антител с антигенами (если таковые имелись в исследуемом образце), после чего избыток несвязавшихся антител смывается буфером, а пленку рассматривают под флуоресцентным микроскопом. Если в образце присутствовал антиген патологии, с его молекулами будут прочно связаны молекулы меченных флуоресцеином антител и под микроскопом можно наблюдать зеленое окрашивание.
Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) представляет собой прямое выявление как корпускулярных, так и растворимых антигенов при люминесцентной микроскопии. Метод является скрининговым и основными показаниями к его применению являются острая, хроническая формы заболевания, необходимость установления этиологии инфекционного процесса. Его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител могут составлять 60 % и 80 % соответственно. Методика требует ее исполнения опытным лабораторным работником, высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко бывает доступной, в частности, оценка эффективности лечения. ПИФ недостаточно чувствительна для определения малых количеств элементарных телец — возможны ложноотрицательные результаты.
Рис. 19. Иммунофлуоресцентное исследование
Диагностическое значение результатов, полученных методом прямой иммунофлуоресценции (ПИФ). Известно, что при использовании метода ПИФ относительно часто получают также ложноположительные результаты, поэтому его предлагается использовать только как ориентировочный (скрининговый) метод выявления патогена. Получение ложноположительных результатов может быть обусловлено, прежде всего, низким качеством диагностических наборов и субъективным характером трактовки получаемых данных. Несмотря на появившееся скептическое отношение к использованию метода иммунофлуоресценции, он остается весьма распространенным.
Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. — enzyme-linked immunoSorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов.
Иммуноферментный метод также основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу. В основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) лежит принцип взаимодействия иммуносорбента — антигена возбудителя инфекции — с выявляемыми антителами и в соединении этого комплекса антиген-антитело с иммуноглобулинами, содержащим ферментную метку.
Иммуноглобулины, применяемые в таких тест-системах, так называемый конъюгат, может быть получен на основе антивидовых антител (например кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса (M, G, А).
В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определенного класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M).
Существует несколько методов постановки реакции, однако в настоящее время используются в основном следующая схема (рис. 20).
Рис. 20. Схема проведения иммуноферментного анализа:
а — антитела против антигена сорбированы на стенках пробирки; б — добавление исследуемой сыворотки к искомым антигенам, которые взаимодействуют с антителами и фиксируются на стенках пробирки; в — введение антител к данному антигену, меченных ферментом (пероксидазой), которые также фиксируются на стенках пробирки; г — добавление перекиси водорода и хромогена, который под действием кислорода, выделяющегося при разложении Н2О2 пероксидазой, изменяет свой цвет на желтый
Вначале на стенках полистироловых пробирок сорбируют антитела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемую сыворотку (или другой биологический субстрат). Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н2О2) и хромогены. Фиксированный к стенке пробирки фермент (пероксидаза) разлагает Н2О2 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают спектрофотометрически или визуально.
Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе (рис. 21). В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем — смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.
Рис. 21. Иммуноферментный анализ, выявление антигена прямым и непрямым методами твердофазного ИФА
По такому принципу построена основная масса тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.
Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счет антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приеме лекарственных препаратов; у новорожденных ложноположительные реакции могут возникать за счет образования в организме ребенка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции.
В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител подразделяются на:
• лизатные — в которых используется нативный антиген (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
• рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;
• пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.
Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.
Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного антигена.
Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы высокоиммуногенными (т.е. в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (т.е. характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрестных реакций с антителами другой природы).
Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удается достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.
Таким образом, за счет несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) — в настоящее время этот метод является одним из основных в лабораторной диагностике.
Методика. Используются специальные 96-луночные (8 рядов по 12 лунок) планшеты из полистирола, с круглыми плоскодонными лунками вместимостью около 300 мкл.
Перед анализом планшету сенсибилизируют, нанося раствор антигена. Обычно это не целая структура возбудителя, а часть (наиболее характерная) белков его оболочки. Очень часто антигены для ИФА получают генно-инженерными технологиями, выращивая на трансгенных E. сoli.
Растворимые антигены закрепляются на поверхности планшеты рядом специфических взаимодействий непосредственно из раствора. Для снижения помех участки незанятой антигеном поверхности «укрывают» нанесением раствора бычьего сывороточного альбумина. Несвязанный материал удаляют и планшету сушат. Сенсибилизированные планшеты можно хранить при –18 °C не более 2 недель.
При выполнении анализа лунки заполняют исследуемым материалом (сыворотка крови), нанося его в разные лунки с дробным разбавлением (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и т.д.), после чего выдерживают около 30 мин для связывания. Если в образцах имеются антитела, комплементарные нанесенному антигену, они образуют с ним прочные комплексы. Содержимое из лунок удаляют трехкратной промывкой буфером и несвязавшийся материал удаляется при промывке.
Далее лунки заполняются раствором конъюгата, представляющего собой связанные глутаровым альдегидом молекулы белка-фермента (чаще всего — пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) и молекулы антител против антител к возбудителю, полученные из сыворотки кролика (или другого организма) при введении в его кровь антител человека к искомому возбудителю. Дают время на прохождение реакции комплементарного связывания, после чего избыток раствора конъюгата удаляется и лунки промываются буфером. Молекулы конъюгата осаждаются на молекулах осадившихся на антигене антител из испытуемого образца. В довершение всего лунки заполняют раствором субстрата, превращение которого в окрашенный продукт осуществляется конъюгированным ферментом. Такое ферментативное превращение осуществляется примерно 60 мин, после чего реакция останавливается добавлением кислоты. Количество превращенного субстрата пропорционально концентрации конъюгата и, следовательно, концентрации антител против возбудителя в исследуемом образце. По плотности окраски в УФ-свете можно судить о концентрации антител в исследуемой сыворотке. В «холостых» контрольных лунках параллельно проводят реакцию для установления порога «шумов». Имеются также лунки, заполненные антителами из контрольного раствора для проверки специфичности реакции.
В качестве субстратов для конъюгатов с пероксидазой хрена применяется о-фенилендиамин в смеси с перекисью водорода, дающие после остановки реакции оранжево-коричневые растворы, измеряемые при 492 нм. Субстратом для щелочной фосфатазы является п-нитрофенилфосфат, превращающийся в п-нитрофенол, индицируемый при 405 нм.
ИФА повышает чувствительность анализа благодаря «усилению сигнала» на конъюгированном ферменте. На каждую молекулу исследуемого в сыворотке антитела «садится» по одной молекуле фермента, которая способна катализировать превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Однако и чувствительность ИФА имеет ограничения. В первые дни после заболевания число антител в крови может оказаться настолько малым, что ИФА часто дает так называемую «серонегативную реакцию».
Современные методы иммунологии позволяют обнаруживать в биологических средах ничтожно малые количества некоторых органических и неорганических веществ (гормонов, ферментов, витаминов, биологически активных веществ, антител к определенным тканям и органам, лекарств и т.п.), которые не выявляются классическими биохимическими и иммунологическими методами. Наиболее чувствительными являются радиоиммунный и иммуноферментный методы исследования.
Радиоиммунологический анализ (РИА)
Радиоиммунный метод является наиболее информативным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченого радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде.
С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие антигена, добавляют известное количество такого же меченого антигена и стандартное количество антисыворотки с соответствующими антителами (рис. 22, а). Если в исследуемой жидкости отсутствует искомый специфический антиген, то около 70–80 % меченого антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность образующегося преципитата (рис. 22, б). Если же в биологической среде присутствует искомый антиген, он конкурирует с меченым антигеном и связывает часть антител. В результате радиоактивность преципитата падает по сравнению с контролем (рис. 22, в). На этом принципе основано количественное определение антигенов или антител.
Рис. 22. Принцип радиоиммунного метода:
а — добавление в исследуемую жидкость стандартной антисыворотки с антителами и антигена, меченного радиоактивным изотопом; б — образование радиоактивных преципитатов при отсутствии в исследуемой жидкости искомого антигена; в — при наличии искомого антигена
РИА — один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1–2 сут. при температуре 40 °C, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом 125J) и продолжают инкубацию еще 24 ч. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 23). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, последние не вступают в связь с меченым антигеном и поэтому он не обнаруживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и известного количества меченого антигена с активными центрами антител.
Рис. 23. Радиоиммунологический анализ:
1 — антиген; 2 — антитело; 3 — радиоактивная метка
Следует добавить, что в последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела.Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемым моноклоном, т.е. культурой клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген.
Для диагностики какой – либо одной болезни часто приходится использовать целый набор серологических методов диагностики. Особенно показателен в этом отношении бруцеллез. Для диагностики бруцеллеза применяют две серологические реакции — РА и РСК. Первой выявляют свежие случаи болезни, второй — развитие инфекционного процесса. В качестве арбитражного метода используют и третий тест— реакцию Кумбса, поскольку синтез неполных антител завершает образование полных антител, улавливаемых в РА и РСК. Кроме того, экспериментально доказано совпадение результатов исследования животных на бруцеллез реакциями агглютинации, связывания комплемента, Кумбса (РК) с показаниями метода флуоресцирующих антител (МФА) в непрямом варианте. Таким образом, последняя реакция принципиально информативнее всех предыдущих диагностических тестов (рис. 14). Она может регистрировать антитела классов М, G как полные, так и неполные.
Рис. 14. Принципы серологического тестирования бруцеллезного процесса у рогатого скота
Диагностическими серологическими тестами не удаётся строго разграничить вакцинальный и эпизоотический процессы у бруцеллезного скота. Их можно разграничить при исследовании классов иммуноглобулинов в динамике. Если, скажем, через 1,5–2 месяца синтез IgM снизится или заместится синтезом IgG, то это будет характеризовать эпизоотический процесс, связанный с репликацией возбудителя в организме. Можно также использовать антиген, позволяющий разграничить вакцинальный и эпизоотический процессы.
|
|
|
