 |
Количественное определение лизоцима в сыворотке крови
|
|
|
|
Лизоцим — гидролитический фермент, расщепляющий высокомолекулярные полисахариды бактерий (пептидогликан), находится в тканях, секретах, экскретах (за исключением пота и мочи), действует бактерицидно на многие бактерии. Присутствие и активность лизоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lysodeicticus.
Готовят 1%-ный агаровый гель (Дифко) на 0,15M фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар температурой 60–70 °C вносят ацетоновый порошок биомассы М. lysodeicticusиз расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты перемешивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В застывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм.
Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного белка. Для этого лизоцим разводят в 015M ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5; 1; 3; 5, 10; 20; 40 и 70 мг/мл. По 0,05 мл каждого разведения лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 °C и измеряют диаметр зоны лизиса М. lysodeicticus вокруг лунок.
По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса.
Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1:5, вносят по 0,03 мл в лунки и далее поступают как при определении активности стандартного лизоцима. Измерив диаметр зоны лизиса, по калибровочной кривой вычисляют содержание лизоцима в исследуемой пробе.
Количественное определение комплемента в сыворотке крови
Комплемент (С) представляет собой сложную систему главным образом неактивных белков крови. Процесс их активации (по классическому пути) запускается образованием комплекса антиген-антитело (АГ-AT) и происходит в виде цепной реакции: комплекс АГ-АТ + С1 + С4 + С2 + С3 + С5 + С6 + С7 + С8 + С9. В процессе активации образуется литический комплекс, который делает мембрану клетки проницаемой, внутрь клетки осмотически поступает вода, в результате клетка набухает и лопается. Такое разрушение клеток (антигенов) под влиянием антител и комплемента получило название иммунного лизиса. Наиболее эффективно комплемент действует на бактериальные клетки в сочетании с лизоцимом. Кроме того, бактериальные клетки (антигены) после взаимодействия с антителами и комплементом легче поглощаются фагоцитами.
|
|
|
Количество комплемента в крови (сыворотке крови) определяют в реакции иммунного лизиса с использованием эритроцитов барана и гемолизина в качестве антител к эритроцитам барана. Эритроциты барана, обработанные гомологичными антителами и чувствительные в таком состоянии к литическому действию комплемента, называют гемолитической системой. Количество комплемента измеряют в гемолитических единицах (СН50). За единицу комплемента принимают такое его количество в объеме 0,5 мл, которое за 30 мин при 37 °C обусловливает лизис 50 % эритроцитов в 0,5 мл гемолитической системы (5%-ная суспензия эритроцитов барана в веронал-мединаловом буферном растворе с pH 7,3–7,4 + гемолизин в тройном титре).
Исследуемую сыворотку в возрастающих дозах разливают по пробиркам (например, 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,10 мл), добавляют ФСБР до 0,5 мл, вносят во все пробирки по 0,5 мл стандартизированной гемсистемы. Одновременно ставят контроль на резистентность эритроцитов (0,5 мл ФСБР + 0,5 мл гемсистемы). Пробирки встряхивают и выдерживают при 37 °C 30 мин, охлаждают при 2–4 °C 10 мин, центрифугируют при 3000 об/мин 15–20 мин, насадочную жидкость колориметрируют и по коэффициенту экстинкции определяют процент гемолиза при помощи заранее построенной калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят следующим образом: к 1 мл 5%-нойсуспензии эритроцитов добавляют 3 мл дистиллированной воды, эритроциты при этом полностью лизируются (100%-ный гемолиз). Из полученного лизата путем добавления буферного раствора готовят пробы с 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90%-ным гемолизом. На фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность каждой пробы (кювета шириной 1 мм, синий светофильтр), затем на оси абсцисс откладывают процент гемолиза, а на оси ординат — коэффициент экстинкции. СН50 вычисляют по дозе сыворотки, дающей гемолиз, наиболее близкий к 50 %. Для этого используют специальную формулу (Крога) или, что проще, коэффициенты, рассчитанные по этой формуле.
|
|
|
Например, если исследуемая сыворотка в разведении 1:25 дает 30%-ный лизис, то СН50 в 1 мл составит 25 · 0,844 = 21,1 ед.
Фагоцитоз бактерий
К фагоцитирующим клеткам относят полиморфноядерные лейкоциты крови. Поглощение микробной клетки фагоцитом может не сопровождаться гибелью микроорганизма (незавершенный фагоцитоз) или приводить к внутриклеточному перевариванию захваченных бактерий (завершенный фагоцитоз).
Белой мыши внутрибрюшинно сначала вводят 2 мл стерильного МПБ, через 2–3 ч — 0,5 мл культуры эшерихий. Спустя 20–40 мин шприцем из брюшной полости отбирают экссудат, делают мазки на предметном стекле, фиксируют спирт-эфиром, окрашивают метиленовым синим (экспозиция 2–3 мин). При микроскопировании можно наблюдать различные стадии фагоцитоза: поглощение, деструкцию (переваривание) клеток (рис. 6 цветной вкладки).
Методы оценки активности фагоцитирующих клеток. Для оценки активности фагоцитов используют следующие показатели: 1) фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофильных лейкоцитов;
Фагоцитарное число — среднее число микробных клеток, поглощенных одним лейкоцитом (характеризует интенсивность фагоцитоза).
Определение фагоцитарного показателя: в чистую стерильную центрифужную пробирку вносят 0,2 мл 2%-ного раствора цитрата натрия, 0,1мл крови, взятой у морской свинки или кролика, и 0,05 мл суспензии убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, E. coli или др. (концентрация 0,5·109 клеток по оптическому стандарту мутности). Компоненты перемешивают и выдерживают при 37–38 °C 30 мин, затем центрифугируют при 2500–3000 об/мин 15–20 мин до образования прозрачного слоя плазмы, слоя эритроцитов и тонкого сероватого среднего слоя лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, делают три—пять мазков и окрашивают по методу Романовского – Гимзы. Препарат микроскопируют, подсчитывают не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих.
|
|
|
Определение фагоцитарного числа. В мазках, которые были приготовлены для определения фагоцитарного показателя, подсчитывают 100 нейтрофильных лейкоцитов и суммарное количество захваченных ими бактериальных клеток, затем определяют фагоцитарное число. Например, 100 лейкоцитов поглотили 500 бактериальных клеток, следовательно, фагоцитарное число равно 500: 100 = 5,0.
Определение опсоно-фагоцитарного индекса. Интенсивность фагоцитоза повышается благодаря антителам — опсонинам, взаимодействующим с микробными клетками. Чтобы определить опсоно-фагоцитарный индекс, сравнивают активность фагоцитов в нормальной и исследуемой (иммунной) сыворотках.
Пастеровской пипеткой набирают на высоту капилляра около 2 см сначала суспензию бактериальных клеток (0,5·109/мл), затем лейкоцитов и, наконец, исследуемую сыворотку. На предметном стекле компоненты перемешивают при помощи пипетки, затем вновь набирают в капилляр, конец которого запаивают. Капилляр помещают в термостат при 37 °C на 30 мин. После инкубирования смесь выливают на предметное стекло, готовят мазок и окрашивают его метиленовым синим (1 мл насыщенного спиртового раствора на 30 мл дистиллированной воды).
Аналогичным образом готовят препарат с нормальной (контрольной) сывороткой. Оба препарата микроскопируют, просматривают 100 нейтрофильных лейкоцитов, определяют количество фагоцитированных бактерий, рассчитывают фагоцитарное число в каждой сыворотке и затем опсоно-фагоцитарный индекс исследуемой сыворотки. Например, в 100 лейкоцитах нормальной сыворотки фагоцитировано 200 бактерий, следовательно, фагоцитарное число 200: 100 = 2. В 100 лейкоцитах исследуемой иммунной сыворотки захвачено 500 бактерий, и фагоцитарное число 500: 100 = 5.
|
|
|
Опсоно-фагоцитарный индекс показывает, во сколько раз процесс фагоцитоза в иммунной сыворотке интенсивнее, чем в нормальной. Его вычисляют делением фагоцитарного числа иммунной сыворотки на фагоцитарное число нормальной сыворотки. В приведенном примере опсоно-фагоцитарный индекс составит 5,0: 2,0 = 2,5.
Проточная цитофлуориметрия
Метод проточной цитофлуориметрии (ПЦ) основан на измерении определенных свойств клеток, вводимых в поток жидкости. Проточный цитометр состоит из трех основных блоков: оптического, где производится измерение, блока обработки сигналов, где сигналы усиливаются и преобразуются из оптических в электрические, блока сбора и обработки данных (компьютер).
Оптический блок предназначен для измерения рассеивания света и флуоресценции. Клетки вводят в поток жидкости, ширина которого составляет 50–100 мкм. На струе сфокусирован лазер. В момент прохождения клеток через луч лазера они рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Переднее рассеивание света в направлении лазерного пучка обусловлено многими параметрами исследуемого объекта, в том числе размером клетки. На основе данного параметра можно отличать жизнеспособные лимфоциты от мертвых и эритроцитов. Перпендикулярное или боковое рассеяние света под углом 90° по отношению к лазерному лучу позволяет различать популяции клеток, таких как лимфоциты, моноциты, нейтрофилы. Флуоресцентные сигналы измеряют с помощью разделяющих, дихроических и обычных зеркал. В большинстве проточных цитометров удается одновременно измерять несколько флуоресцентных сигналов, что дает возможность определять фенотип клетки, степень ее активации, стадию дифференцировки и другие дополнительные характеристики.
В блоке обработки поступающие от детектора сигналы усиливаются и сравниваются на основе выбранных критериев с заданными параметрами. Эта операция позволяет определять, является ли регистрируемое событие тем, которое нас интересует. Выбор интересующих нас событий называется дискриминацией, а ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр, — окнами. Выбор окон — одна из важнейших операций при работе специалиста на цитометре. Включение определенных субпопуляций в анализ и исключение их из него существенно влияют на результаты анализа образцов и зависят от профессионализма специалиста. Из блока обработки сигналы посылаются в блок хранения компьютера. Обычно данные представляют в виде распределений частот встречаемости одного или двух параметров. Эти распределения называют гистограммами, или профилями.
|
|
|
Критическим моментом для адекватного использования цитометра является выбор флуорохрома. Идеальный флуорохром должен обладать следующими свойствами:
1) возбуждаться при нужной длине волны: для цитометра»FacScan» длина волны возбуждения аргонового лазера составляет 488 нм;
2) легко связываться с белками;
3) обладать низким уровнем неспецифического связывания окрашивания;
4) отдавать энергию возбуждения в виде флуоресценции, т.е. иметь высокий квантовый выход;
5) излучение флуорохрома должно лежать в зоне максимальной чувствительности фотодетектора;
6) длины волн излучаемого флуорохромом света не должны совпадать с длинами волн аутофлуоресценции (флуоресценции молекул, присутствующих в анализируемых клетках, но не имеющих отношения к флуорохрому);
7) допускать использование в одном опыте данного флуорохрома одновременно с другими.
Стандартным флуорохромом, применяемым в проточной цитометрии, стал флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), излучающий в зеленой части спектра. Другая удачная находка — флуорохром фико-эритрин, который возбуждается светом той же длины волны, что и ФИТЦ, но излучает в красной части спектра. Это дало возможность применять его в паре с ФИТЦ при «двойном окрашивании».
Клиническое значение результатов исследования иммунного статуса
Главными задачами при оценке иммунного статуса являются иммунодиагностика нарушений иммунной системы, прогнозирование тяжести патологического процесса, оценка эффективности проводимого лечения и профилактика.
Идентификация нарушенного звена иммунной системы дает возможность подтвердить (или отклонить) клинический диагноз.
Выделяют клинические признаки иммунологической недостаточности, которые включают 4 основных синдрома:
1) инфекционный синдром (рецидивирующие, хронические инфекции);
2) аллергический синдром;
3) аутоиммунный синдром;
4) иммунопролиферативный синдром.
Иммунодиагностика при перечисленных синдромах имеет значение для изучения этиопатогенеза заболевания, прогнозирования обострения, для выбора метода лечения и оценки его эффективности.
Методы иммунодиагностики можно разделить на скрининговые и уточняющие. Первые существуют для фиксирования нарушений в иммунной системе, вторые — для установления механизмов, задействованных в их реализации с целью дальнейшей иммунокоррекции.
Стандартный скрининговый тест включает:
• подсчет абсолютного количества лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов;
• определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов различных классов (IgG, IgA и IgM);
• определение гемолитической активности системы комплемента CH50;
• проведение кожных тестов гиперчувствительности замедленного типа.
Гематологический анализатор-автомат (рис. 24) предназначен для:
Рис. 24. Coulter MAXM — настольный автоматический гематологический анализатор на 26 параметров (существует вариант для ветеринарии)
• измерения параметров классической гемограммы;
• дифференциального анализа пяти популяций лейкоцитов;
• гистограммы распределения эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов;
• диаграммы лазерного лейкоцитарного анализа (индикация патологии);
• определения количества ретикулоцитов, их объема и показателя зрелости.
Более детальное изучение иммунного статуса включает изучение количества и функциональной активности клеточного и гуморального звеньев иммунной системы:
• Исследование фагоцитарной функции.
• Исследование системы комплемента.
• Исследование Т-системы иммунитета.
• Исследование В-системы иммунитета.
Рациональным считается исследование иммунного статуса в несколько этапов. Вначале проводятся ориентировочные исследования для выявления значительных дефектов иммунной системы (1-й уровень), затем можно провести более подробное изучение (2-й уровень) основываясь на данных предыдущего исследования.
Тесты 1-го уровня:
• Исследование фагоцитарной функции:
– подсчет абсолютного числа фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов);
– оценка интенсивности поглощения микробов фагоцитами;
– способности фагоцитирующих клеток переваривать захваченные микробы.
• Исследование система комплемента:
– определение гемолитической активности комплемента CH50.
• Исследование Т-системы иммунитета:
– подсчет общего числа лимфоцитов;
– подсчет процента и абсолютного числа зрелых T-лимфоцитов (CD3) и двух основных их субпопуляций: хелперов/индукторов (CD4) и киллеров/супрессоров (CD8);
– определение пролиферативного ответа на основные T-митогены (фитогемагглютинин и конканавалин A).
• Исследование В-системы иммунитета:
– определение концентрации иммуноглобулинов различных классов (G, A, M, E) в сыворотке крови;
– определение процента и абсолютного количества B-лимфоцитов (CD19, СD20) в периферической крови.
Тесты 2-го уровня:
• Исследование фагоцитарной функции:
– оценка интенсивности хемотаксиса фагоцитов;
– определение экспрессии молекул адгезии (CD11a, CD11b, CD11c, CD18) на поверхностной мембране нейтрофилов.
• Исследование Т-системы иммунитета:
– исследование продукции цитокинов (интерлейкина-2 (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6; гамма-интерферона (ИФН-γ); фактора некроза опухоли (ФНО α));
– определение активационных молекул на поверхностной мембране T-лимфоцитов (CD25, HLA-DR);
– выявление молекул адгезии (CD11a, CD18);
– исследование пролиферативного ответа на специфические антигены, чаще всего на дифтерийный и столбнячный анатоксины;
– проведение аллергической реакции с помощью кожных тестов с рядом микробных антигенов.
• Исследование В-системы иммунитета:
– субклассов иммуноглобулинов, особенно IgG;
– секреторного IgA;
– исследование соотношения κ (каппа) и λ (лямбда) цепей иммуноглобулинов;
– определение специфических антител к белковым и полисахаридным антигенам;
– исследование способности лимфоцитов к пролиферативному ответу на митогены B(стафилококк, липополисахарид энтеробактерий) и T-B (митоген лаконоса).
|
|
|
