 |
Глава 3. Методы изучения иммунного статуса организма
|
|
|
|
Определение антителопродуцирующих клеток
Антителопродуцирующие клетки определяют при помощи меченых антител или антигенов. В первом случае наиболее популярным является сэндвич-тест (англ. sandwich — многослойный), смысл которого сводится к последовательному нанесению на мазок-отпечаток или срез лимфоидной ткани сначала взвеси или раствора соответствующего антигена, а затем гомологичной им меченой флуорохромом антисыворотки (МФА). Светящийся антиген локализуется на клетках, продуцирующих антитела, высвечивая их контуры.
Если нужно обнаружить не антитело, а иммуноглобулинпродуцирующие клетки, используют прямой и непрямой варианты МФА с применением меченой антивидовой сыворотки ко всем глобулинам или к иммуноглобулинам определенного класса.
В экспериментальных исследованиях на линейных мышах и крысах для оценки первичного (IgM и IgG) и вторичного (IgG) ответа на тимус-зависимый или тимус-независмый антиген используется метод определения количества антителообразующих клеток in vivo в камере (или агаре) по Cunningham.
Первичный (IgM) гуморальный иммунный ответ in vivo
Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса IgM (IgM-АОК) в селезенке мышей, оценивается на пике иммунного ответа на 4-5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 107 ЭБ/мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом. У мышей после шейной дислокации извлекается селезенка и помещается в пенициллиновый флакон с 0,5 мл среды 199. Каждая селезенка помещается в отдельный флакон. Все процедуры с клетками проводятся на льду. Объем клеточной суспензии доводится до 5 мл; клетки разводятся средой до необходимой концентрации. Затем готовится инкубационная смесь: 300 мкл среды, 100 мкл суспензии ЭБ (4·109 ЭБ/мл), 100 мкл сыворотки морской свинки, предварительно разведенной в 1,5 раза и 500 мкл клеточной суспензии. Компоненты перемешиваются и смесь заливается в стеклянные камеры (по 2 камеры на каждое животное, учитывая среднее), сделанные из двух предметных стекол, склеенных смесью воска с парафином вдоль продольных сторон. Учитывается объем камеры. Камеры помещаются в термостат и инкубируются 90 мин. при +38 °C. После инкубации подсчитываются зоны гемолиза под бинокулярной лупой (×42):
|
|
|
N АОК = n АОК в камере × Объем клет. суспензии × Разведение клеток.
Объем камеры
Вторичный IgG ответ in vivo
Первичная иммунизация проводится внутривенно в дозе 2 % ЭБ в объеме 0,5 мл. Через 30 дней после первичной иммунизации проводится вторичная иммунизация ЭБ в дозе 10·106/мышь внутривенно. Количество IgG АОК определяется в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сутки после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза. Клетки селезенки инкубируются 2 часа при 39 °C в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисывороткой против мышиного IgG (разведение в 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитываются под увеличением ×42. Результаты выражаются в абсолютном количестве IgG АОК в селезенке.
Продукция IgG В-клетками in vitro
Продукцию IgG клетками селезенки и костного мозга, спонтанную и LPS-стимулированную, определяют в супернатантах клеточных культур после культивирования в течение 7 дней. Оптимальная доза LPS E. coli, установленная в предварительных опытах, составляет 30 мкг/мл. Результаты выражают в мкг/мл и индексах стимуляции (IS — отношение разницы между опытом и контролем к контролю).
Концентрацию IgG в периферической крови и супернатантах культур определяют твердофазным вариантом метода иммуноферментного анализа в 96-луночных плоскодонных планшетах фирмы E.I.A. «Linbro» с помощью меченного пероксидазой хрена конъюгата и ОФД в качестве субстрата. В качестве основного буфера используется Tris-NaCl, блокирующего агента — желатин.
|
|
|
Также предварительно должны быть определены оптимальные разведения конъюгатов и антисывороток. Интенсивность реакции оценивают на многоканальном спектрофотометре Multiskan при l = 492 нм. Калибровочную кривую строят по препаратам IgG (Sigma) (10–100 нг/мл). Результаты выражают в абсолютных значениях (мг/мл, мкг/мл).
Оценка клеточного звена иммунной системы
Т-лимфоциты — самая многочисленная (60 %) популяция клеток иммунной системы (ИС), которая в свою очередь разделяется на субпопуляции. Хелперы и супрессоры являются иммунорегуляторными клетками, а киллеры и эффекторы ГЗТ — эффекторными (рис. 15).
Рис. 15. Взаимодействие Т-лимфоцитов
Т-киллеры разрушают инфицированные клетки и клетки опухолей. Существует еще субпопуляция так называемых естественных киллеров (ЕК), они имеют CD56/57+. Это большие гранулярные клетки, в гранулах содержится белок перфорин, который может проникать в мембрану клетки-мишени и в результате полимеризации образовывать мембраноатакующий комплекс (своеобразная «дырка» в мембране), вызывая осмотический «взрыв» и лизис клетки.
Клеточный иммунный ответ разделяют на стадии:
• распознавание антигена макрофагом или другой антиген-презентирующей клеткой;
• обработка антигена макрофагом или другой антиген-презентирующей клеткой;
• презентация обработанного антигена в комплексе с белками МНС I и МНС II (Т-киллеры непосредственно взаимодействуют с комплексом АГ* МНС I, а Т-эффекторы — посредством Т-хелперов);
• передача информации на Т-хелперы;
• передача информации на Т-эффекторы;
• пролиферация и дифференцировка Т-эффекторной популяции под действием интерлейкина.
Т-киллеры при встрече с чужеродной клеткой выделяют перфорин, разрушающий ее мембрану. Т-эффекторы оказывают опосредованное действие: выделяют факторы хемотаксиса, подавления миграции макрофагов и лейкоцитов, активации. Клетки в очаге пролиферации образуют инфильтрат, который окружается фибробластами, продуцируемым ими коллагеном, и становится гранулемой. Гранулема выполняет ограничивающую функцию — локализует процесс воспаления, препятствует его распространению; элиминирующая функция выражена слабо.
|
|
|
Т-клеточные ответы заканчиваются формированием двух субпопуляций эффекторных Т-клеток:
1) цитотоксических Т-лимфоцитов (или Т-киллеров);
2) эффекторных Т-лимфоцитов воспаления.
Оценка клеточного звена иммунной системы включает определение количества (по CD маркерам) различных субпопуляций Т-клеток (CD3,CD4 и др.) с помощью моноклональных антител и изучение их функциональных свойств (пролиферация в ответ на митогены, аллоантигены и др.). Оценка проводится как in vivo, так и in vitro.
|
|
|
