 |
Выделение. Качественное определение. Ксантгидрольная реакция (реакция Пезеца). Реакция Либермана-Бурхардта. Хроматографический метод анализа
|
|
|
|
Выделение
При выделении сердечных гликозидов используются органические растворители (этиловый, метиловый спирты), которые не вызывают гидролиза сердечных гликозидов. Выделение сердечных гликозидов состоит из следующих стадий:
1. Экстракции сердечных гликозидов из растительного сырья.
2. Очистки полученного извлечения.
3. Разделения суммы сердечных гликозидов (колоночная и препаративная хроматографии).
Полученное спиртовое извлечение, содержащее сумму сердечных гликозидов, подвергают очистке от сопутствующих веществ липофильного характера (хлорофилл, каротиноиды, смолы, масла и др. органические вещества, растворимые в спиртах). Для очистки упаренное под вакуумом (t 50-52°С) спиртовое извлечение подвергают многократной обработке органическими растворителями, чаще всего ССI4, или же применяют сорбционные методы очистки.
Разделение суммы сердечных гликозидов проводят чаще всего на хроматографических колонках, заполненных сорбентами (оксид алюминия, силикагель). В дальнейшем нужные зоны элюируют определенными растворителями.
Качественное определение
Качественные реакции проводят или с индивидуальными веществами или с очищенным извлечением из растительного сырья. С этой целью несколько капель извлечения упаривают досуха на часовом стекле или в выпарительной чашке, сухой остаток растворяют в нужном растворителе. Все реакции на сердечные гликозиды условно разделяют на 3 группы:
1. Реакции на углеводную часть молекулы (2-дезоксисахара):
Реакция Келлер-Килиани.
Готовят два раствора:
1) ледяная уксусная кислота, содержащая следы Fe2(SO4)3.
2) концентрированная серная кислота также со следами Fe2(SO4)3.
|
|
|
Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в растворе 1 и осторожно по стенке вливают раствор 2. При наличии дезоксисахаров образуется бурое кольцо, а верхний слой через некоторое время окрасится в васильково-синий цвет.
Ксантгидрольная реакция (реакция Пезеца).
При нагревании ксантгидрола (дибензо-g-пиранола) с испытуемым гликозидом в присутствии ледяной уксусной кислоты и последующем прибавлении нескольких капель серной или фосфорной кислоты появляется красное окрашивание.
2. Реакции на стероидное ядро:
Реакция Либермана-Бурхардта.
Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в ледяной уксусной кислоте и добавляют смесь уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (50: 1). Через некоторое время появляется окраска: от розовой к зеленой и синей.
Реакция Розенгейма.
Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в хлороформе и смешивают с 90% водным раствором трихлоруксусной кислоты. Появляются сменяющие друг друга окраски: до лиловой и синей.
3. Реакции на пятичленное ненасыщенное лактонное кольцо:
Для установления наличия пятичленного лактонного кольца проводят реакции с ароматическими нитрозпроизводными в щелочной среде, с которыми СГ образуют окрашенные продукты:
а) реакция Легаля – с нитропруссидом натрия – быстро исчезающее красное окрашивание;
б) реакция Кедде – с 3, 5-динитробензойной кислотой – красно-фиолетовое окрашивание;
в) реакция Бальета – с пикриновой кислотой – оранжевое окрашивание.
На шестичленное лактонное кольцо не найдены достаточно специфические реактивы. Для подтверждения шестичленного лактонного кольца в буфадиенолидах в качестве реактива применяют раствор треххлористой сурьмы. Для этого гликозид растворяют в хлороформе и добавляют постепенно насыщенный раствор треххлористой сурьмы. При нагревании образуется лиловое окрашивание. Раствор треххлористой сурьмы в хлороформе используется для обнаружения буфадиенолидов на хроматограммах.
|
|
|
Реакция Татье.
К спиртовому извлечению прибавляют 2-3 капли концентрированной соляной кислоты со следами хлорида железа (III) и нагревают. Агликоны буфадиенолидов дают красное окрашивание.
Хроматографический метод анализа
1. Лантозиды наперстянки шерстистой.
Хроматография проводится в тонком слое сорбента (тальк). На стартовую линию на расстоянии 1, 5 см от нижнего края наносят пятна раствора гликозидов по 0, 01 мл и пятна свидетелей. Пластинку помещают в камеру и хроматографируют восходящим способом 30-35 мин. Длина пробега подвижной фазы не менее 12 см. В качестве подвижной фазы используется система: ХЛОРОФОРМ – ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ – БЕНЗОЛ – ФОРМАМИД (59: 10: 30: 1).
Пластинку высушивают на воздухе 5 мин, затем 10 мин. в сушильном шкафу при температуре – 120°С. Пластинку обрабатывают 25% раствором трихлоруксусной кислоты в этиловом спирте с добавлением 0, 2% раствора хлорамина Т. После обработки пластинку высушивают 10 мин. в сушильном шкафу при температуре 120°С. Лантозиды А, В, С проявляются в виде пятен серо-синего цвета. В УФ – свете лантозид А обладает ярко-желтой флуоресценцией; В – зеленовато-голубой; С – голубой.
2. Сердечные гликозиды ландыша.
Из очищенного водного экстракта гликозиды извлекают смесью хлороформ – метиловый спирт (4: 1). Фильтруют через безводный сульфат натрия, упаривают в чашке досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси хлороформ – метиловый спирт (1: 1) и хроматографируют восходящим способом в системе этилацетат – вода (2: 1) в течение 20-24 часов (на бумаге). Делятся конваллотоксин, дезглюкохейротоксин. Если хроматографировать нисходящим способом, то делятся и другие сердечные гликозиды. Проявитель – насыщенный раствор треххлористой сурьмы в метаноле. Пятна сердечных гликозидов окрашиваются в розово-фиолетовый цвет.
Количественное определение
Активность сердечных гилкозидов в препаратах и в лекарственных формах определяют биологическим методом. Активность устанавливают сравнением с препаратами-стандартами и выражают в ЛЕД (лягушачьих), КЕД (кошачьих) или ГЕД (голубиных единицах действия). Препараты-стандарты представляют собой индивидуальные кристаллические гликозиды. Они содержат известное количество единиц действия. При биологическом методе контроля устанавливают наименьшие дозы стандартного и испытуемого препаратов, которые вызывают систолическую остановку сердца подопытных животных. Затем рассчитывают содержание единиц действия в 1, 0 г исследуемого препарата. В нормативной документации на лекарственное растительное сырье, содержащее сердечные гликозиды указывается валор. Валор – количество единиц действия в 1, 0 г сырья.
|
|
|
Недостаток биологического метода – его трудоемкость и малая точ-ность. Поэтому для количественной оценки все шире применяют фото-колориметрический, спектрофотометрический, хроматоспектрофото-метрический методы, а также флуориметрический, полярографический методы и метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ).
|
|
|
