Окраска жгутиков. Метод окраски жгутиков по Грэю

Окраска жгутиков

Хотя Кох разработал способ окраски жгутиков более чем сто лет назад, существующие в настоящее время методики не отличаются легкостью и надежностью. Поскольку толщина бактериальных жгу­тиков лежит за пределами разрешения светового микро­скопа (жгутики имеют диаметр около 10—30 нм), для того чтобы их увидеть, необходимо, так сказать, «выма­зать их дегтем и обвалять в перьях». Неподвижные бак­терии лишены жгутиков, однако известны организмы, жгутики которых «парализованы». Для обнаружения жгутиков у микробных клеток специальные прописи предусматривают применение протрав, которые способствуют осаждению на жгутиках препаратов железа или серебра —происходит искусственное на­ращивание поперечника жгутиков, и они лучше видны под микроскопом. При окраске на жгутики, ввиду их хрупкости, необходимо соблю­дать специальные предосторожности, касающиеся как самой культуры и способа изготовления мазка, так и подготовки стекол. Культура, предназна­ченная для окраски на жгутики, должна быть свежей, не старше 12—20 часов роста при соответствующей температуре на твердой среде (преимущест­венно агаровой). Материал берут самым легким прикосновением петли к сре­де. Затем петлю с материалом вводят в пробир­ку с 2—3 мл стерильной (лучше водопро­водной) воды и, держа петлю неподвижно 1—2 минуты или осторожно погружая ее 3—4 ра­за в воду, дают самим микробам посте­пенно распределиться в воде. Через 15—20 ми­нут, когда микробы равномерно распределятся в среде, платиновой петлей осторожно берут материал и наносят на подготовленное стекло. Нанесенную каплю не размазывают по стеклу, а, дав ей подсохнуть, фиксируют на пла­мени или одним из химических способов фиксации. Предметные или покровные стекла для изготовления препаратов на жгутики должны быть абсолютно чистыми. Обычно стекла для этой цели обрабатывают по способу Цетнова. Дальнейшие подробности о технике окраски на жгутики даны при описании отдельных способов.

Метод окраски жгутиков по Грэю

Краситель желательно добавлять к остальным ингредиентам непосредственно перед использованием, конечный раствор отфильтровать.

Методика:

1. Обычные бактерии удобно выращивать на косячках агара с соответствующим содержанием питательных веществ. За 0, 5 ч до взятия пробы в пробирку с косяч­ком добавляют водный раствор пептона, в который пере­ходят микроорганизмы, так как жидкая среда является наиболее подходящей в подобных экспериментах. Затем пробу центрифугируют, чтобы освободиться от состав­ных элементов среды, промывают и вновь центрифуги­руют. Осадок осторожно (чтобы предотвратить потерю жгутиков) ресуспендируют в 10%-ном (объем/объем) водном формалине до получения слегка мутной суспен­зии.

2. Суспензию петлей наносят на предметное стекло, наклоняют его под углом 45° и подсушивают препарат на воздухе.

3. Фильтруют прямо на мазок раствор А и оставля­ют его на нем приблизительно на 6 минут. Точное время следует определить экспериментально.

4. Раствор А смывают с предметного стекла дистил­лированной водой.

5. На мазок кладут кусочек промокательной бумаги и заливают на 3 минуты раствором Б.

6. Удаляют промокательную бумагу, промывают предметное стекло дистиллированной водой, осторожно подсушивают впитывающим влагу материалом и смот­рят в микроскоп.

Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в красный цвет. Значительная доля успеха в осуществлении ме­тода зависит от использования абсолютно чистых обез­жиренных предметных стекол. Чтобы обеспечить чисто­ту стекол, их нагревают либо в пламени горелки Бунзена, до тех пор пока пламя по краям стекла не становит­ся желтым (после чего стеклам дают остыть), либо в муфельной печи в течение 20 минут при 400°С (предмет­ные стекла в печи располагают так, чтобы они не сопри­касались). После охлаждения стекла используют немедленно или хранят в емкости, не содержащей пыли. Стекла также становятся очень чистыми, если их сна­чала протереть жидким очистителем, а затем бумажной тканью. Не рекомендуется применять для очистки стекол, на которых красят жгутики, такие очищающие агенты, как хромовая кислота или 50%-ный (объем/объем) спирт.