Способ Кауфмана. Способ Ионе. Окраска спор. Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру

Способ Кауфмана

Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут. Краску смывают водой и мазок погружают в 0, 5% раствор азотнокислого серебра или в 0, 25% водный раствор протаргола на 3—4 минуты, затем окрашивают карболовым раствором фуксина, разведенным в 20 раз, в течение 5—10 секунд, промывают в воде и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы — темно-красные, бактерии —темно-синие.

Способ Ионе

Фиксированный мазок окрашивают 2% водным раствором метилвиолета (или генцианвиолета) в течение 1—2 минут при подогревании. Краску быстро смывают небольшим количеством воды, мазок обрабатывают 2% водным раствором уксусной кислоты в течение 10 секунд, промывают в воде и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы — розовато-фиоле­товые, бактерии — темно-фиолетовые.

Окраска спор

При исследовании живых неокрашенных препаратов, изготовленных из старых, главным образом, агаровых культур, споры чаще всего обнаружи­ваются в виде овальных или круглых образований, резко преломляющих свет. Зрелые споры обычными растворами красок не окрашиваются. В микробной клетке споры располагаются или в центре ее (экваториально), или на конце (терминально), или ближе к концу палочки (субтерминально). Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. После протравливания препараты окраши­вают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка, после­дующим обесцвечиванием и дополнительной окраской.

Неокрашенные споры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамле­ние и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии — это эндоспора, особенно если отсут­ствует информация о теплоустойчивости.

Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благо­даря явлению, которое наблюдается во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0, 1% KМnO₄ в 0, 3н НNО₃ или 0, 3н НСl). При этом оболочка споры теряет целост­ность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашивае­мая основными красителями, выпячивается наружу че­рез образовавшуюся брешь. Из-за поразительной скоротечности происходящего события (менее 20 минут пребы­вания в растворе окислителя) этот тест заслуживает названия «проверки на лопанье» (popping test). Его удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10—20 минут в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.

Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них — негативного окрашивания — по­лучают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взя­тый петлей 7% (вес/объем) водный нигрозин сме­шивают на покровном стекле с набранной петлей куль­турой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и вы­сушивают на воздухе. Покровное стекло переворачива­ют пленкой вниз, помещают на предметное стекло и закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндо­споры выглядят, как сильно преломляющие свет сфери­ческие или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий.

Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашива­нию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию.

Полезным методом пози­тивного окрашивания бактериальных эндоспор является метод Дорнера.

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру

1. Образец, фиксированный нагреванием на предмет­ном стекле, высушивают на воздухе и покрывают квадратным кусочком фильтровальной бумаги или сал­фетки, подогнанным по размеру стекла.

2. Насыщают бумагу раствором карболового фуксина и выпаривают его 5-10 минут, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере испарения. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой.

3. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают мазок смесью кислоты и спирта в течение 1 минуты. Промы­вают водопроводной водой и подсушивают промокатель­ной бумагой.

4. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 минут в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения до­бавляют 0, 5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).

Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окраше­ны в красный цвет, а фон — в черный.

В модифицированном методе Дорнера смешивают в пробирке водную суспензию бактерий с равным объ­емом карболфуксина. Пробирки опускают на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-ный водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подверг­шейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушивания на воздухе образуется тонкий мазок. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.

⇐ Предыдущая10111213141516171819Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: