 |
Самостоятельная работа. Методические указания. Изучение морфологических свойств дрожжей. Определение включений в клетках дрожжей
|
|
|
|
Самостоятельная работа
1. Изучить морфологию клеток винных, пекарских и диких дрожжей в препарате «раздавленная капля». Выявить делящиеся клетки. Определить относительное количество живых и мертвых клеток в пекарских дрожжах.
2. Изучить содержание включений в дрожжевой клетке:
а) изучение содержания гликогена в пекарских дрожжах;
б) обнаружение жира в пекарских дрожжах;
в) обнаружение волютина в пивных дрожжах.
3. Определить размер дрожжевой клетки одной из культур.
4. Оформить протокол исследования.
Методические указания
Изучение морфологических свойств дрожжей
Для микроскопирования дрожжей следует приготовить препарат «раздавленная капля» из чистых культур дрожжей – винных, пекарских, пивных и диких. Приготовленные препараты изучить под микроскопом с объективом 40х. При этом необходимо рассмотреть, прежде всего, форму клетки и ее строение, обратить внимание на клеточную оболочку, цитоплазму, вакуоли и включения запасных питательных веществ. Цитоплазма при микроскопировании представляет собой темную зернистую массу, вакуоли и капли жира в виде светлых (блестящих) пятнышек, гликоген – в виде уплотненных зерен. Необходимо убедиться в неподвижности дрожжевых клеток.
Затем изучают способы бесполого размножения дрожжей. Для этого нужно отыскать в поле зрения микроскопа почкующиеся клетки. Все препараты зарисовать. На рисунках обозначить анатомическое строение дрожжевых клеток, почкующиеся клетки. В выводе указать отличие изученных препаратов дрожжей по форме.
Определить относительное количество живых и мертвых клеток в пекарских дрожжах – старых и подмоложенных. К капле суспензии дрожжей на предметном стекле добавить каплю слабого раствора (1: 1000) метиленового синего, размешать, накрыть покровным стеклом. Мертвые клетки прокрашиваются быстрее и ярче вследствие посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки. Препарат зарисовать в цвете.
|
|
|
Определение включений в клетках дрожжей
В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в цитоплазме клеток могут формироваться морфологические образования, представляющие собой либо продукты обмена клетки, либо запасные питательные вещества. Включения различны по своей химической природе. Это могут быть жироподобные вещества, полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), серополифосфаты (волютин), кристаллы щавелевой кислоты и др. Они не являются постоянными компонентами клетки, а образуются в зависимости от условий культивирования, возраста культуры и могут использоваться в метаболизме клетки. Клеточные включения могут выявляться цитохимическими методами.
1. Определение полисахаридов (гликогена и гранулезы):
а) на предметное стекло наносят небольшую каплю микробной суспензии, добавляют каплю концентрированного раствора Люголя и выдерживают 10–15 мин при комнатной температуре.
б) накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с сухой системой либо с иммерсией.
Гранулы крахмалоподобных веществ (гранулеза) окрашены в синий, а гранулы гликогеноподобных веществ (крахмал) – в красновато-коричневый цвет.
Окрашивание гликогена происходит в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют либо на предметное стекло вместо воды наносят каплю 0, 5%-го раствора HCl и в ней эмульгируют исследуемую культуру.
2. Обнаружение жироподобных веществ.
Жировые включения или липидные гранулы в клетках микроорганизмов могут быть представлены нейтральными жирами и поли- β -оксимасляной кислотой. Коэффициент преломления жиров и гранул, состоящих из нейтральных жиров, отличается от коэффициента преломления протоплазмы, поэтому в препарате «раздавленная капля» жир виден в клетках в виде блестящих ярких капелек. Препарат необходимо рассматривать в затемненном поле зрения, опустив конденсор и закрыв диафрагму (объектив 40х). Гранулы поли-β -оксимасляной кислоты выявляют с помощью жирорастворимого красителя судана (III).
|
|
|
а) наносят каплю густой микробной взвеси на предметное стекло; добавляют каплю формалина 40 %, либо 5 % раствора HCl и выдерживают 5 мин (формалин убивает клетку и разрыхляет ее оболочку).
б) добавляют каплю метиленового синего (1: 10 либо 1: 40) и выдерживают 10 мин;
в) добавляют каплю концентрированного раствора судана (III) в 90% -ом этаноле и выдерживают 5 мин. Накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с сухой или иммерсионной системой.
Клетки окрашены в синий, включения жира – в розово-оранжевый цвет.
3. Выявление волютина
Волютин – полиметафосфат, запасное фосфор- и азотсодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты. В клетках чаще содержится в виде зерен диаметром 0, 3 мкм, иногда в дисперсном состоянии. Встречается в клетках многих бактерий и большинства дрожжей. Волютин дает явление метахромазии, т. е. способности приобретать иной цвет, чем цвет окрашиваемого вещества. На этом основана его окраска метиленовым синим. Растворяется в слабых кислотах и щелочах, но после окраски становится кислотоустойчивым, на этом основан метод Омелянского.
Окраска метиленовым синим: фиксированный мазок дрожжей окрашивают метиленовым синим 3–5 мин, промывают водой и, не высушивая, наносят на мазок небольшую каплю 1%-го раствора серной кислоты; мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина выглядят сине-фиолетовыми на фоне голубой протоплазмы.
Метод Омелянского: фиксированный мазок окрашивают в течение 30 с фуксином Циля, затем обесцвечивают 1%-ным раствором серной кислоты 30 с и после промывания водой докрашивают метиленовым синим 1 мин. Далее промывают водой, высушивают и микроскопируют в иммерсионной системе. Зерна волютина – ярко-красные, протоплазма – голубая. Препараты зарисовать в цвете.
|
|
|
