Приготовление препаратов фиксированных клеток

Фиксированные окрашенные препараты используют для выявления ряда морфологических особенностей, количественного учета микроорганизмов, а также для проверки чистоты культуры. Под фиксацией подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. При светопольной микроскопии фиксированные окрашенные препараты имеют ряд преимуществ перед прижизненными: высокую контрастность, возможность дифференцированного выявления клеточных структур, безопасность работы, длительность сохранения препарата. Фиксированные окрашенные препараты рассматривают с иммерсией (см. ниже). Их приготовление включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло наносят исследуемый материал как для препарата «раздавленная капля» и равномерно распределяют его петлей или краем покровного отекла на площади 1–2 см² возможно более тонким слоем.

Высушивание мазка. Препарат сушат при комнатной температуре на воздухе. Тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание мазка замедленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки мазком вверх. Эту операцию проводят очень осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация преследует несколько целей: обеспечить прикрепление клеток к стеклу и тем самым предохранить препарат от смывания; сделать мазок более восприимчивым к окраске, поскольку мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые; сделать безопасным дальнейшее обращение с мазком, что особенно важно, если клетки исследуемого микроорганизма являются патогенными. Фиксацию клеток осуществляют различными химическими соединениями и высокой температурой. Весьма распространенный способ фиксации – термическая обработка. Препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом могут произойти грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание. После фиксации клетки микроорганизмов окрашивают.

Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым красителям относятся те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), – анион. У основных красителей хромофором является катион. Примером кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все эти красители интенсивно связываются с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки. Основные красители ‑ метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, сафранин – более интенсивно связываются с ядерными (кислыми) компонентами клетки.

При исследовании микроорганизмов применяют почти исключительно основные красители, так как бактерии в отношении красителей ведут себя так, как если бы они состояли в основном из нуклеиновой кислоты, которая легко реагирует с основными красителями, что приводит к окрашиванию клетки.

Некоторые красители характеризуются избирательным химическим сродством к отдельным компонентам клетки (ядерному веществу, включениям) и применяются для их выявления. Так, зерна волютина хорошо красятся хризоидином, метиленовым синим, зерна гранулезы и гликогена – раствором йода, зерна жира – суданом III. Способность микроорганизмов к окрашиванию называется тинкториальным свойством.

Различают простые и сложные способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. При дифференциальной окраске в большинстве случаев окрашивается не вся клетка, а лишь определенные ее структуры. Последний способ окраски используют для изучения некоторых клеточных структур, а также для характеристики и идентификации микроорганизмов.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются анилиновыми красителями: фуксином, генциановым фиолетовым. Фиксированный препарат помещают на две параллельные стеклянные палочки, соединенные резиновыми шлангами и лежащие на стенках кюветы, и заливают раствором красителя на 1–3 мин. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными оказываются только клетки микроорганизма.

Фиксировать и окрашивать можно также и препараты " отпечатки". Окрашенный мазок микроскопируют с иммерсионным объективом 90^х.

Сложные методы окраски заключаются в последовательном окрашивании двумя или несколькими красителями. Один из сложных методов окрашивания – окраска бактерий по методу Грама, которая является дифференциальной и широко используется для определения видовой принадлежности бактерий. По этому способу одни бактерии прочно окрашиваются в сине-фиолетовый цвет комплексом красителя генцианфиолетового с йодом (грамположительные бактерии, гр. +), другие обесцвечиваются в процессе окраски и выявляются только при дополнительном окрашивании в красный цвет фуксином (грамотрицательные бактерии, гр. –). Способность бактерий окрашиваться по Граму связана с молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки бактерий.

Красители можно разделить на позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов и другие объекты. Из красителей, применяемых в микробиологии, большинство относится к позитивным. Они окрашивают клетки при комнатной температуре в течение 30–60 с.

Негативные красители окрашивают пространство, окружающее клетки микроорганизмов. В результате клетки выглядят силуэтами на окрашенном фоне.

Некоторые микроорганизмы (например, спирохеты) и отдельные структуры (внеклеточная слизь), плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, хорошо прокрашиваются негативными красителями. Споры без соответствующей обработки не прокрашиваются, и поэтому при окрашивании клеток бацилл позитивными красителями они имеют вид преломляющих свет включений в вегетативных клетках.