 |
Техника окраски по Граму. Самостоятельная работа. Методические указания. Занятие 5. Выявление клеточных структур прокариот
|
|
|
|
Техника окраски по Граму
На фиксированный мазок кладут сухую фильтровальную бумагу, пропитанную генцианфиолетовым, наносят на бумагу 2–3 капли воды и окрашивают 2 мин, снимают бумагу и, не промывая препарат водой, наносят на мазок 2–3 капли раствора Люголя на 1 мин; сливают реактив Люголя и для обесцвечивания наносят на мазок 96 % этиловый спирт на 30 с, промывают препарат водой и наносят раствор водного фуксина на 1 мин; промывают препарат водой, просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионным объективом. Бактерии, окрашенные в синий цвет – грамположительные, в красный – грамотрицательные.
Самостоятельная работа
1. Приготовить и промикроскопировать прижизненные и фиксированные мазки демонстрационных препаратов, окрашенных простым способом.
2. Промикроскопировать при малом увеличении на бинокулярном микроскопе с парными окулярами колонии культур стрептомицетов на чашках Петри. Зарисовать форму края колоний, субстратный и воздушный мицелий, форму спороносцев.
3. Приготовить из этих же культур препараты «раздавленная капля» и «отпечаток». Промикроскопировать с объективом 40х и зарисовать.
4. Приготовить фиксированный мазок зубного налета, окрасить его по методу Грама, промикроскопировать, зарисовать препарат.
5. Оформить протокол исследования.
Методические указания
1. Приготовить на предметном стекле три мазка из чистых культур бактерий различной формы, зафиксировать мазки и окрасить простым способом.
2. Культуры стрептомицетов, выращенные на питательной среде в чашках Петри, изучают непосредственно на чашке при малом увеличении (объектив 10х), помещая открытую чашку на предметный столик микроскопа. При этом можно видеть, что гифы мицелия частично внедряются в субстрат, частично стелются по поверхности и приподнимаются над ней. Просматриваются спорофоры со спорами. Из этих же культур готовят препараты для микроскопического изучения: на предметное стекло наносят каплю 10% -го раствора щелочи (KOH или NaOH) или 70–90%-го раствора уксусной кислоты или 60%-го этанола, в которой расщепляют с помощью двух препаровальных игл мицелий, взятый с небольшим кусочком подлежащей питательной среды. Препарат плотно накрывают покровным стеклом и микроскопируют с объективом 40х. На таком препарате хорошо видна разница в толщине субстратных и воздушных гиф, форма спороносцев. Для изучения типа спорообразования, формы и размера спор готовят препарат «отпечаток». Для приготовления такого препарата покровное стекло плотно прижимают к поверхности колонии, а затем покровное стекло помещают на предметное стекло в каплю воды отпечатком вниз; микроскопируют с объективом 40х.
|
|
|
3. Приготовить мазок из зубного налета и окрасить его по методу Грама. Для этого на предметное стекло наносят каплю воды, осторожно снимают зубной налет спичкой (без серной головки), растирают в капле тонким слоем, мазок подсушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают. Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки были распределены равномерно по поверхности стекла и не образовывали скоплений, т. к. от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания.
Приготовленные окрашенные мазки микроскопируют с помощью иммерсионного объектива 90х. Обратить внимание на форму клеток, их группировки, выявить наличие спор. Споры обычно в окрашенных препаратах не прокрашиваются, так как их оболочка непроницаема для краски, и они просматриваются в виде светлого пятна в клетке.
При окраске по Граму возможны следующие ошибки: все клетки синие из-за недостаточного обесцвечивания; все клетки бледно-розовые вследствие недостаточного окрашивания генциановым фиолетовым (много воды на бумаге) или чрезмерной обработки спиртом; редкие клетки в поле зрения – мало взято зубного налета или плохое поле зрения. Обратить внимание на равномерное окрашивание клеток бактерий по Граму, что не позволяет выявить внутриклеточные включения.
|
|
|
В протоколе исследования привести методику приготовления фиксированных препаратов, окрашенных простым способом, и рисунки демонстрационных препаратов с названием форм бактерий и их агрегатов; методику окраски по Граму, рисунки препарата, окрашенного по Граму и его описание.
Занятие 5. Выявление клеточных структур прокариот
Цель занятия: ознакомление со структурными элементами прокариотных клеток.
Вопросы для обсуждения:
1. Капсулы микроорганизмов, их состав и функции.
2. Клеточная оболочка грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, строение, химический состав. Методы окраски.
3. Жгутики, их строение и расположение. Методы выявления.
4. Ядро и ядерная субстанция микроорганизмов (нуклеоид).
5. Споры микроорганизмов. Окраска по методу Ожешко.
План занятия:
1. Ознакомление с основными структурными элементами микробной клетки.
2. Самостоятельная работа: выявление капсул микроорганизмов, клеточной оболочки, нуклеоида, спор.
|
|
|
