 |
Самостоятельная работа. Задача 1. Выявление капсулы микроорганизма Leuconostos vesenteroides. Задача 2. Выявление клеточной оболочки
|
|
|
|
Самостоятельная работа
1. Приготовление и окраска мазка по методу Бурри-Гинса Leuconostos mesenteroides.
2. Выявление клеточной стенки и ядерных элементов у дрожжей Sacchromyces cerevisiae (просмотр готовых препаратов).
3. Приготовление и окраска по методу Ожешко мазка из чистой культуры Bac. subtilis.
4. Оформление протокола исследования.
5. Подготовка чашек Петри, пипеток, шпателей Дригальского для стерилизации.
Задача 1. Выявление капсулы микроорганизма Leuconostos vesenteroides
Метод Бурри. На край обезжиренного предметного стекла наносят каплю туши, а рядом с ней каплю воды, в которую вносят петлей культуру микроорганизма. Затем обе капли быстро и тщательно перемешивают и из смешанной капли быстро делают мазок углом другого предметного стекла по типу приготовления мазка крови. Затем мазок тщательно высушивают на воздухе и микроскопируют в иммерсионном масле (объектив 90х).
Метод Бурри-Гинса. Мазок приготавливают по методу Бурри, фиксируют над пламенем или в смеси Никифорова (этанол+эфир – 1: 1), затем окрашивают фуксином Циля, разведенным водой в соотношении 1: 3. наливая краситель на поверхность мазка на 2 мин, осторожно промывают водой, чтобы снять остатки краски, но не удалить слой туши, высушивают на воздухе и микроскопируют в иммерсионной системе. Бактериальные клетки красного цвета, окруженные бесцветными капсулами, хорошо видны на темном фоне.
Модифицированный метод Бурри-Гинса. На край предметного стекла помещают каплю разбавленного водой (1: 1) карболового фуксина Циля, в которую вносят петлей исследуемую культуру. Через 2–3 мин к ней добавляют каплю туши, тщательно перемешивают и готовят препарат «мазка крови». Мазок полностью высушивают на воздухе и микроскопируют в иммерсионной системе. Клетки окрашиваются в красный цвет, капсулы бесцветные, тушь создает темный фон.
|
|
|
Приготовление туши. Одну часть туши смешивают с девятью частями дистиллированной воды и стерилизуют при 1атм 30мин в пробирках, закрытых ватными пробками. Вместо стерилизации можно добавлять к туши несколько капель формалина. Подготовленную таким образом тушь выдерживают две недели, пока все взмученные частицы не осядут на дно. Для приготовления препарата осторожно берут только верхнюю часть отстоявшейся жидкости.
Задача 2. Выявление клеточной оболочки
Метод Пешкова. Препарат фиксируют 15 мин в жидкости следующего состава: 90% этанол – 60 мл, хлороформ – 30 мл, концентрированная уксусная кислота – 10 мл, погружая его в стакан с фиксатором или наливая фиксатор на поверхность мазка. Затем фиксатор сливают и препарат протравливают 3–5 мин в 10% водном растворе таннина, наливая его на поверхность мазка. Мазок тщательно промывают водой, после чего окрашивают 60 с водным фуксином, сливают его и, не промывая, сушат и микроскопируют в иммерсионной системе. Клеточная стенка окрашивается в черный, а цитоплазма в бледно-розовый цвет.
Задача 3. Окраска ядерных элементов клеток
Приготавливают мазок, высушивают, фиксируют в смеси Никифорова 10 мин. Готовят рабочий раствор красителя из расчета 2 капли готовой краски Романовского-Гимзы на 1 мл дистиллированной воды, имеющей нейтральное значение рН, так как от этого зависят результаты окрашивания. Для окрашивания предметное стекло помещают на стеклянные палочки мазком вниз в раствор красителя, который налит в плоскую кювету или чашку Петри. Продолжительность окрашивания 20 мин. Затем препарат тщательно промывают дистиллированной водой до тех пор, пока струи воды не станут прозрачными, и после просушивания микроскопируют в иммерсионной системе. При этом ядра и ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма – светло-розовый.
|
|
|
Задача 4. Выявление спор у бацилл (Bac. subtilis)
Метод Ожешки. Приготавливают мазок и высушивают его, не фиксируя; наливают на мазок 0, 5%-ный раствор хлороводородной кислоты, которая служит в качестве протравы, подогревают 1-2 мин и сливают кислоту; мазок промывают водой, просушивают, фиксируют над пламенем спиртовки. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются.
Далее обесцвечивают протоплазму клеток (но не споры), обрабатывая 1 % раствором соляной или серной кислот в течение 15-30 с. При превышении этого времени могут обесцвечиваться споры. Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин.
Если все операции сделаны правильно, окраска получается контрастной и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы. Карболовая кислота, входящая в состав фуксина Циля, является гидролизующим агентом, размягчающим оболочку споры. Размягчению способствует также повышенная температура. Фуксин, проникший в спору и окрасивший ее, прочно удерживается и не обесцвечивается серной кислотой, в то же время вегетативные клетки обесцвечиваются кислотой и заново окрашиваются метиленовым синим.
Метод Пешкова. На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15– 20 сек, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0, 5 % водным раствором нейтрального красного. Еще раз промывают, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или синий цвета, цитоплазма – в розовый.
Для исследования спор удобными объектами могут служить Bacillus mesentericus или Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.
В протоколе исследования по данной работе привести методики выявления капсул, клеточной оболочки, ядерных элементов и спор, рисунки объектов исследования.
|
|
|
