 |
1. Идентификация возбудителя. 1.1. Подготовка образцов
|
|
|
|
1. Идентификация возбудителя
Метода, способного подтвердить присутствие ГЭ КРС у живых животных, не существует. Идентификацию возбудителя начинают с клинического подозрения на болезнь или послесмертной демонстрации гистопатологических изменений и скоплений PrPSc в подозрительных животных или неподозрительных животных посредством активного надзора. Природа возбудителя остается гипотетической и поэтому его нельзя выделить с целью проведения диагностики. Однако PrPSc повсеместно считается сообразным маркером болезни и все современные методы диагностики, за исключением клинического исследования и гистопатологии, основаны на обнаружении данного белка.
В отсутствии методов выделения возбудителя in vitro, болезнь можно подтвердить посредством обнаружения ТГЭ-специфичной вакуолизации с помощью гистопатологического исследования разных частей мозга.
Гистопатологические диагностические исследования, основанные на исследовании одной части продолговатого мозга (на уровне обекса), были валидированы в противоположность более обширному исследованию стволовой области мозга. Этот упрощенный подход позволил осуществить пробоотбор из стволовой области мозга через большое затылочное отверстие с использованием специальных инструментов вместо удаления целого мозга.
Однако иммунохимические методы обнаружения PrP, специфичного к болезни, включая методы иммуногистохимии и Вестерн-блоттинга рекомендуются для подтверждения диагноза и улучшения диагностической чувствительности в ранних или аутолизированных случаях. Применение более быстрых методов in-vitro, таких как иммуноферментный анализ ИФА с целью обнаружения PrPSc, привело к разнообразию «экспресс» тестов, которые сейчас являются основными инструментами скрининга для активного надзора. При использовании таких тестов проводят предварительную диагностику. Положительные или неопределенные результаты данных тестов подлежат исследованию посредством подтверждающих методов иммуногистохимии и Вестерн-блоттинга. В настоящее время использование экспресс тестов является основной методикой обнаружения случаев болезни и их широкое использование для подтверждения было одобрено при условии, что одним из используемых тестов является Вестерн-блоттинг (http: //www. tse-lab-net. eu/documents/tse-oieguide. pdf). Все известные в настоящее время формы ГЭ КРС можно обнаружить с использованием данных методов, хотя полной
|
|
|
оценки чувствительности и специфичности атипичных форм (типов L и Н) не проводилось.
Использование конкретного метода будет зависеть от области его использования. Области использования могут быть различными: от подтверждения клинического диагноза до скрининга здоровых популяций для выявления скрытой или доклинической стадии болезни. Принятое патологическое определение случая также будет отличаться в зависимости от того, будет ли использоваться диагноз для подтверждения случая или для скрининга популяции. Необходимо быть осторожными при интерпретации данных диагностических исследований с использованием методологий, которые не позволяют делать сравнение с описанными здесь стандартами для подтверждающей диагностики. Без соответствующего сравнения с раннее опубликованными критериями, определяющими фенотип ГЭ КРС, и при отсутствии исследований трансмиссии, результаты диагностических исследований, которые указывают на идентификацию нового штамма, являются преждевременными.
Контроль качества (КК) и обеспечение качества (ОК) являются неотъемлемыми частями процедур тестирования и за консультацией можно обратиться в референтные лаборатории МЭБ. Независимо от того, идентифицируют ли инфицированных ГЭ КРС животных посредством пассивного или активного надзора, хорошей практикой является обнаружение и подтверждение болезни с использованием комбинации, по крайней мере, двух методов. Первоначальный тест может быть одним из описанных ниже подтверждающих тестов или экспресс тестом, но для подтверждения положительных или неопределенных результатов первоначального теста важно проводить второе тестирование. В том случае, когда наблюдается противоречие между результатами первого и второго тестирования, необходимо проводить дальнейшие тесты с использованием иммуногистохимии или Вестерн-блоттинга или образцы необходимо отправлять в референтную лабораторию МЭБ для принятия решения.
|
|
|
1. 1. Подготовка образцов
Статус страны по ГЭ КРС, должное выполнение программ пассивного и активного надзора и применяющиеся диагностические методы будут оказывать влияние на стратегию пробоотбора.
При всех обстоятельствах пассивного надзора за нейрологической болезнью взрослого крупного рогатого скота, если распространение ГЭ КРС в рамках страны или штата не установлено или имеет низкую инцидентность, очень важно следовать стандартному нейропатологическому подходу, при котором
осуществляется отбор образцов целого головного мозга и исследуются репрезентативные области всего головного мозга. КРС с подозрениями на болезнь должен быть умерщвлен путем внутривенной инъекции концентрированного раствора барбитурата после введения седативного препарата, при необходимости. Мозг необходимо удалить как можно быстрее после смерти, используя при этом стандартные методы. Не существует макроскопических повреждений, связанных с ГЭ КРС, поэтому если при извлечении мозга они имеются, то пробы нужно брать непосредственно из них для того, чтобы облегчить дифференциальную диагностику.
Необходимо быть осторожным, чтобы сохранить соответствующие зафиксированные образцы и свежие образцы мозга для обнаружения PrPsc с использованием иммуногистохимических и иммунохимических исследований. Отклонение от данного подхода, заключающегося в отборе и сохранении целого мозга, может помешать проведению соответствующей характеристики случая с целью подтверждения того, является ли он типичным для ГЭ КРС или нет. Гистопатологические и иммуногистохимические исследования сначала выполняются на одном срезе блока (0, 5-1, 0 см в ширину) у обекса продолговатого мозга (Рис. 1. а и b., уровни А-А, представляющие центр блока для исследования), который должен быть зафиксирован в течение минимум 3-5 дней (в зависимости от толщины блока) в 4% растворе формальдегида (то есть 10% формол-солевом фиксаторе или 10% нормальном буферном формалине [NBF]). Для снижения инфекционности зафиксированные ткани можно поместить в 98% муравьиную кислоту на один час для снижения прионной инфекционности, затем промыть в течение 30 минут в водопроводной воде. Необходимо отметить, что это может уменьшить количество дальнейших исследований, которые могли бы использоваться для классификации за исключением случаев, когда свежий замороженный материал является также доступным. Последующую гистологическую обработку следует проводить в отношении нервных тканей посредством традиционных методов помещения в воск. (Пример соответствующих методов обработки можно найти на TSE-LAB-NET (http: //www. tse-lab-net. eu/documents/tse-oie-rl-prp. pdf. )
|
|
|
Свежий материал, предназначенный для использования в иммунологических тестах для обнаружения PrPSc, сначала следует брать в виде полусреза
продолговатого мозга до уровня обекса или полного коронарного среза (2-4 г), непосредственно рострального или каудального по отношению к блоку обекса, отбираемого для фиксации. Все остальные области мозга должны быть разделены плоскостным парамедиальным разрезом (3-5 мм от середины). Меньшую часть сохраняют для проведения иммунохимических методов для обнаружения PrPsc (например, иммуноблот) и хранят в замороженном виде до начала тестирования (в том случае, если тестирование не проводилось непосредственно после отбора образцов). После отбора образцов из области обекса для фиксации и пробоотбора свежей ткани большую часть ткани мозга в неизменном виде помещают в приблизительно 4-6 литров 10% формалинового фиксатора, который следует менять дважды в неделю. После двухнедельной фиксации, если необходимо дальнейшее исследование, мозг можно разрезать на коронарные срезы. Время фиксации может быть сокращено посредством разрезания свежего ствола мозга (отделенного от остальной части мозга) на маленькие коронарные срезы подобно первоначальному удалению области обекса, но оставляя интактными оставшиеся, важные с диагностической точки зрения, площади сечения на уровнях ножек мозжечка и ростральной части холмы (Рис. 1а и b, уровни В – В и С-С соответственно). В зависимости от некоторых других факторов (температуры, перемешивания, толщины блока ткани и использования микроволн) время фиксации для этих маленьких частей мозга может быть сокращено. Однако оценка влияния ускоренных процессов фиксации подобного типа на последующие протоколы иммуногистохимических исследований должна удовлетворять стандартам сравнительных испытаний. Другие части мозга, зафиксированные в формалине, можно использовать для проведения дифференциальной диагностики после завершения стандартной двухнедельной фиксации.
|
|
|
Рисунок 1. Стволовая часть головного мозга после удаления мозжечка a) вид сзади и b) вид сбоку. Рекомендованные уровни разрезов: А-А = продолговатый мозг, у обекса; В-В = продолговатый мозг через каудальные ножки мозжечка; С-С = средний мозг через ростральные холмы
Когда ГЭ КРС зарегистрирована у местной популяции КРС в определенной стране и существуют доказательства того, что локализация поражений и другие аспекты фенотипа болезни соответствуют аспектам, описанным для классической ГЭ КРС, то с целью подтверждения и мониторинга адекватным, хотя и не идеальным, методом является извлечение только ствола головного мозга.
Это можно сделать через большое затылочное отверстие без удаления свода черепа (Рисунок 2). Этот метод уменьшит количество необходимого фиксатора, а также требуемого времени и оборудования, и тем самым снизит затраты и повысит безопасность. Основные области-мишени для проведения гистологических исследований, тем не менее, можно сохранять. Данный метод позволяет отбирать и исследовать большое количество образцов для проведения пассивного и активного надзора на бойнях и в отношении павших животных. Ствол головного мозга разрезают через большое затылочное отверстие, не вскрывая череп, с использованием специального инструмента в виде неглубокой ложки с острыми краями. Такие инструменты имеются в продаже. Возможно, что различные формы инструмента предполагают различные варианты используемых методов, поэтому важно, чтобы после утверждения используемого оборудования специалисты прошли обучение. Обучение должно включать информацию о распределении PrPSc на срезах стволовой части мозга и необходимости точного отбора образцов и сохранения областей-мишеней для диагностики (Смотри ниже).
|
|
|
Рисунок 2. После отделения головы от тела посредством разрезания между позвонками позвоночника и затылочного мыщелока черепа, его помещают на подставку лицевой стороной вверх (А) так, чтобы в большом затылочном отверстии был виден каудальный конец стволовой части мозга (продолговатый мозг) (Смотри В, развернутый рисунок черепа). Инструмент (С) вводят через большое затылочное отверстие между твёрдой мозговой оболочкой и лицевой/дорсальной частью (в зависимости от подхода) продолговатого мозга и продвигают рострально, так чтобы выпуклость чаши инструмента касалась кости черепа, и продвигают из стороны в сторону вращательными движениями. Таким образом, отделяют корешки черепно-мозгового нерва, стараясь не повредить при этом ткань мозга. Инструмент продвигают рострально в данном направлении на, приблизительно, 7 см и затем резко поворачивают под углом (т. е. к дорсальной/лицевой части стволовой части мозга, в зависимости от подхода), чтобы разрезать и отделить стволовую часть мозга (с фрагментами мозжечка) от остальной части мозга. Затем инструмент, который находится в положении под углом, вынимают из черепа и извлекают ткань через большое затылочное отверстие.
Когда индексный случай идентифицируют посредством проведения активного надзора, необходимые области мозга для проведения полной фенотипической
характеристики, вероятнее всего, получить будет невозможно. В большинстве стран отбирают только стволовую часть мозга даже перед первичным подтверждением ГЭ КРС. Следует предусмотреть, чтобы образцы, отобранные у животных, в рамках активного надзора сохранялись до получения результатов первоначального тестирования. Это позволит провести полный отбор образцов мозга животных с положительными реакциями в ретроспективе с целью характеристики случаев. Это является особенно важным, если используются внутренние тесты, не подлежащие внешнему контролю качества, и в тех случаях, когда заявление об идентификации новых фенотипов сделано при отсутствии прямого сравнения с описанными здесь методами. В тех случаях, когда в качестве инструмента первичного надзора используются экспресс методы иммунологических исследований, необходимо обеспечить материал для проведения дальнейших морфологических (включая иммуногистохимию) и молекулярных исследований, которые позволят идентифицировать фенотип болезни в ситуации, когда диагностика ГЭ КРС в стране вообще не проводилась.
|
|
|
