1.2.2.3. Экспресс-методы тестирования

Были разработаны экспресс Вестерн-блоттинг, анализ бокового потока и методы ИФА, которые позволяют проводить скрининг большого количества образцов головного мозга и которые являются коммерчески доступными. Проведение таких методов занимает несколько часов (смотри оценки ЕС экспресс-тестов для обнаружения ГЭ КРС в группах отрицательных и положительных по результатам иммуногистохимии образцов5). Оцененные и утвержденные в ЕС тесты для контроля ГЭ КРС перечислены в Приложении С, Главе Х Регламента по ТГЭ (ЕС 999/2001 и последующие поправки).

5 http: //www. tse-lab-net. eu/test. html

6 http: //www. tse-lab-net. eu/documents/tse-oie-guide. pdf

7 http: //www. inspection. gc. ca/english/anima/disemala/bseesb/surv/protoce. shtml

8 http: //www. maff. go. jp/nval/english/pdf/outline130325. pdf

9 http: //www. oie. int/en/our-scientific-expertise/certification-of-diagnostic-tests/background-information/

С алгоритмом проведения данных тестов можно познакомиться на сайте референтной лаборатории МЭБ в Великобритании6.

В то время как многие страны и рабочая группа МЭБ по тестированию на ГЭ КРС признают разрешение, выданное ЕС, в качестве индикатора эффективности теста, другие создали свои собственные механизмы оценки, в частности, Соединенные Штаты Америки, Канада и Япония (Протоколы Канады по надзору за ГЭ КРС7; Национальная лаборатория по исследованиям в области ветеринарии, Министерство сельского хозяйства, лесных и рыбных хозяйств, краткое описание нормативной системы по ветеринарным препаратам Японии 8).

МЭБ имеет процедуру выдачи разрешения, а протоколы таких оценок размещены на сайте МЭБ: Валидация и сертификация диагностических тестов 9, и процедура выдачи разрешений ЕС была признана в качестве золотого стандарта для дальнейшей оценки в соответствии с допустимой чувствительностью и специфичностью.

Относительная чувствительность экспресс-тестов, иммуногистохимии и других подтверждающих методов не

была полностью установлена, так как, по определению, все тесты не могут быть использованы в отношении идентичных образцов и распределение PrPSc анатомически различно.

(В качестве компромисса можно использовать гомогенаты ткани или смеси измельченных тканей, что позволит получить некоторую информацию в отношении определенных видов тестов). Признание этого является особенно важным при оценке эффективности экспресс-тестов при проведении исследований животных, не имеющих клинических признаков ГЭ КРС и у которых, вероятнее всего, депонирование PrPSc ниже, чем у животных с заболеванием на поздней стадии. Экспресс тесты являются инструментом первоначального скрининга животных в течение последних нескольких месяцев инкубационного периода (Arnold et al., 2007), например, при исследовании материала, отобранного во время патологоанатомического исследования животных, подлежащих плановому убою. В странах, где проводится надзор по обнаружению новых случаев возникновения ГЭ КРС и в странах где считается, что средство оценки превалентности ГЭ КРС должно быть независимым от системы нотификации подозрительных случаев, данные скрининг-тесты предлагают эффективный подход. С тех пор как с января 2001 активный скрининг стали использовать в Европе, при помощи данных тестов идентифицируют большинство животных, инфицированных ГЭ КРС и они являются предпочтительными первичными тестами. Однако подтверждение диагностики ГЭ КРС в идеале требует проведения исследований зафиксированного мозга посредством иммуногистохимии или использования соответствующего протокола Вестерн-блоттинга. В 2006 году МЭБ признало, что при использовании в программах активного надзора коммерческие экспресс-методы доказали свою эффективность и стабильность, при условии, что их проводят обученный соответствующим образом персонал.

Конечно, иногда они могут превосходить признанный стандарт сравнения, если обучение сотрудников и опыт применения данного стандарта являются недостаточными. В настоящее время при данных обстоятельствах считается приемлемым для диагностики и практически идеальным для характеристики, если экспресс-тесты используются в комбинации для первичного скрининга в рамках программ активного и пассивного надзора и последующего подтверждения. Однако важно, чтобы первичные и вторичные тесты были совместимыми, и чтобы не возникла опасность получения ложноположительных результатов из-за использования одинаковых реагентов. Таким образом, алгоритм комбинаций предпочтительного теста будет помещен на TSE-LABNET с тем, чтобы помочь тем, кто хочет использовать данный метод вместо гистопатологии и иммуногистохимии или Вестернблоттинга для подтверждения. Комбинация тестов должна включать метод Вестерн-блоттинга для получения полезной дополнительной информации, которая поможет при фенотипической характеристике образца, если исследования зафиксированной ткани не проводится. Подтверждение должно проводиться в национальной референтной лаборатории.

Комбинацию двух экспресс-тестов можно использовать только для подтверждения случая ГЭ КРС. Отрицательный результат вторичного тестирования является недостаточным для определения случая, как отрицательного, если результаты первичного исследования положительные.

Необходимо продолжать проводить исследования животных с подозрением на ГЭ КРС, результаты тестирования которых при помощи экспресс-методов были противоречивыми, используя Вестерн-блоттинг или иммуногистохимию для обнаружения PrPSc. Если эти методы недоступны, нужно использовать гистопатологию.

Если при помощи гистопатологии нельзя подтвердить первые результаты реакции, то образцы необходимо отправить в референтную лабораторию МЭБ для проведения дальнейших исследований.

Несмотря на то, что программы оценки теста, проводимые в Европе, поддерживали законодательство по надзору за ГЭ КРС, последствия распространяются на другие страны. Последствия ложноположительных или ложноотрицательных результатов настолько велики, что внедрение новых тестов должно сопровождаться тщательной оценкой эффективности теста. Свойства, заявляемые производителями теста, должны быть всегда подкреплены данными, которые, в идеале, прошли независимую оценку. Необходимо обратить внимание на то, что имело место ограничение процесса полной валидации всех вышеуказанных диагностических методов обнаружения ГЭ КРС из-за отсутствия достоверного золотого стандарта и необходимости последующего использования стандартов сравнения, основанных на немногочисленных исследованиях. Таким образом, необходимо продолжать опубликовывать результаты широкомасштабных исследований эффективности испытаний. Пока ни одни из опубликованных данных не сравнивали с утвержденными процедурами валидации тестов для обнаружения других болезней.